[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗(yàn)技術(shù)(文件)
【正文】 1）通過(guò)熒光顯微鏡觀察可測(cè)知抗原的存在及部位； （ 2）依熒光強(qiáng)弱也可測(cè)知抗原量的差異。應(yīng)用 FITC進(jìn)行溶解。 一般以低溫標(biāo)記為最好。 ? 鏡檢： ? 在熒光顯微鏡下進(jìn)行檢查，抗原所在部位呈黃綠色熒光。 ? 對(duì)照： ? 需用正常血清處理作為對(duì)照，此對(duì)照片應(yīng)無(wú)熒光。 ? ２、 酶標(biāo)抗體的制備 ? 用于標(biāo)記的抗體要求高純高、高效價(jià)、與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，以提取的 IgG最為理想。如 戊二醛交聯(lián)法 。 (2) 于上液中加入 NaIO４溶液，室溫下避光攪拌 20分鐘。 (6) 將上述液裝入透析袋中，對(duì) PBS透析，4℃ 過(guò)夜。 酶標(biāo)抗體的應(yīng)用 —— 免疫酶技術(shù) ? 其基本過(guò)程是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶試驗(yàn)，底物顯色后，用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果，其過(guò)程如下。 ? 用途 : 酶標(biāo)二抗 熒光標(biāo)記二抗 ? 兔抗豬高免血清的制備 免疫原： 豬血清 豬 IgG 制備程序： 采取 豬血、分離血清 提取IgG 取 豬 IgG接種于 家兔 （一般３次，每次間隔１０天左右，劑量遞增） 最后一次注射后１０左右采血檢測(cè)其瓊擴(kuò)效價(jià)，達(dá)１：３２－６４以上時(shí)，大量采血，分離血清。 ? 常用的免疫動(dòng)物 ? 免疫的基本步驟 ? 兔子（ rabbit）、雞 (chicken)：最常用于自制抗體，抗體量較多。 ? 馬（ horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用 抗體（商品）。 ? ? ② 強(qiáng)化免疫： 基礎(chǔ)免疫后 2３周左右開(kāi)始進(jìn)行高度免疫，注射 Ag多為 強(qiáng)毒 ，免疫原性良好，免疫劑量逐漸增加，免疫次數(shù)視血清抗體效價(jià)而定，一般 12次。 ? （２）注射途徑一般采用注射，最好采用分點(diǎn)注射，每一注射點(diǎn) Ag不宜過(guò)多。 ? ② 油乳佐劑： 油水不溶，但在乳化劑存在的情況下，高速攪拌可使二者形成乳劑而制成的佐劑。 ? 制苗時(shí)，將油相于勻漿機(jī)內(nèi)，在低速攪拌下，緩緩加入水相（水相 =1： 23）后繼續(xù)高速攪拌 2分鐘，制成乳白色的油包水型油乳苗，分裝。 在大多數(shù)情況下 ， 免疫血清 、 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清以及腹水中的抗體需經(jīng)純化后再用于各種免疫學(xué)檢測(cè)中去 。 鹽析法原理 蛋白質(zhì)在不同鹽濃度的溶液中其溶解度不一樣。 ? 蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)可以隨著緩沖液 pH的改變而改變，當(dāng) pH7以上時(shí)，大多蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，而 DEAE纖維素帶正電荷，當(dāng)血清通過(guò) DEAE纖維素柱時(shí)，蛋白質(zhì)即借靜電吸附在纖維素柱上。故應(yīng)用 TrisHCl作為洗脫液。 ? 洗脫一般采用改變 pH值的方法 使用前 樣品結(jié)合 (Binding) 洗脫 (Elution) ?血清 硫酸銨沉淀 透析 過(guò) 凝膠過(guò)濾柱 過(guò) DEAE纖 維素柱 IgG 。 (分子篩 ) ? 原理 ? 將樣品混合物通過(guò)一定孔徑的凝膠介質(zhì) ,由于流經(jīng)路徑的差異 ,使不同分子質(zhì)量的組分分離 . ? 大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過(guò)，走得快；小分子物質(zhì)進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來(lái)，走得慢。 IgG ， IgM， IgA的等電點(diǎn)分別為 pH 、 、 。在 : 50％硫酸銨 : 所有的免疫球蛋白都可沉淀； 33％硫酸銨 : 大部分 IgG可沉淀出來(lái)； 40％硫酸銨 : 沉淀物的得率最高，但含 IgM、 IgA等 β 球蛋白部分增多。 這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn) ， 應(yīng)根據(jù)抗體的特點(diǎn) 、 純度要求和實(shí)驗(yàn)室具體條件加以選擇 。用時(shí)佐劑與抗原等量混合。 劑型： 油包水型、 水包油型 水相（ Ag） 油相 油相 水相 常用的油性佐劑有： A、白油佐劑 油相： 94%白油、 6%司本 80（去水山梨醇單油酸酯）、 2%硬脂酸鋁，加熱、融化、高壓滅菌。 ? 氫氧化鋁膠佐劑： ? 最簡(jiǎn)單的制備方法： AlCl3+3NaOH Al(OH)3+3NaCl 5份 Ag液 +1份鋁膠 ，室溫 2— 4天，棄去部分上清液，混勻分裝。每次注射強(qiáng)毒、 Ag間隔時(shí)間為 57天。 ? ①基礎(chǔ)免疫： 一般先用 弱毒苗 /滅活苗
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