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[自然科學(xué)]免疫學(xué)試驗技術(shù)(留存版)

2025-04-06 05:20上一頁面

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【正文】 ? 原理 ? 利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合 (抗體 抗原,受體 配體)將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合 ,捕捉與它相配的物質(zhì)。 ? 卡介苗等分支桿菌細胞壁中的粘肽( 胞壁酰二肽, MDP)具有很強的佐劑活性,它能活化巨噬細胞,在注射部位形成肉芽腫,吸引吞噬細胞,進一步增強吞噬細胞和淋巴細胞的活性,使其更易于捕獲抗原。有時還需進行 3次以上的免疫。 ? 酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme linked immunosorbent assay)簡稱 ELISA: 用于可溶性抗原或抗體的定量 , 是一種既特異又敏感的方法 。根據(jù)有色產(chǎn)物的有無及濃度,可對抗原及抗體做定性、定位和定量測定。 ? FITC的標記如下: ? ① 濃縮后的 IgG、定量、稀釋( 10~20mg/ml) . ? ② FITC按蛋白量的 1/80- 1/100加入。 ? 常用的微載體: 致敏紅細胞、聚苯乙烯乳膠、炭粉顆粒 Ag + (紅細胞、乳膠、炭) 載體 載體 Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag Ag 間接凝集反應(yīng) Ag ?將抗原結(jié)合在微載體上進行的凝集試驗叫 “ 正向間接凝集試驗 ” ; 將抗體結(jié)合在微載體上進行的凝集試驗叫 “ 反向間接凝集試驗 ” 。 在 Ag、 Ab在凝膠中擴散的同時加入電場作用,使 Ag、 Ab的擴散速度加快,同時限制了擴散的方向,增加了試驗的敏感性。 ? 鏡檢: ? 在熒光顯微鏡下進行檢查,抗原所在部位呈黃綠色熒光。 (2) 于上液中加入 NaIO4溶液,室溫下避光攪拌 20分鐘。 ? 常用的免疫動物 ? 免疫的基本步驟 ? 兔子( rabbit)、雞 (chicken):最常用于自制抗體,抗體量較多。 ? ② 油乳佐劑: 油水不溶,但在乳化劑存在的情況下,高速攪拌可使二者形成乳劑而制成的佐劑。 ? 蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)可以隨著緩沖液 pH的改變而改變,當(dāng) pH7以上時,大多蛋白質(zhì)帶負電荷,而 DEAE纖維素帶正電荷,當(dāng)血清通過 DEAE纖維素柱時,蛋白質(zhì)即借靜電吸附在纖維素柱上。 IgG , IgM, IgA的等電點分別為 pH 、 、 。 劑型: 油包水型、 水包油型 水相( Ag) 油相 油相 水相 常用的油性佐劑有: A、白油佐劑 油相: 94%白油、 6%司本 80(去水山梨醇單油酸酯)、 2%硬脂酸鋁,加熱、融化、高壓滅菌。 ( BALB/C,昆明鼠) ? 大鼠( rat):可用于自制抗體,免疫過程要麻醉動物。 (4) 加 20μl 碳酸鹽緩沖液,使以上醛化的 RP的 PH升高到 ~ ,然后立即加入 10mg IgG(抗體 )在 1ml ,室溫避光輕輕攪拌 2小時。 ? 間接法 ? 制片:同直接法 ? 染色: 染色時 , 標本先滴加抗血清 , 在37℃ 處理 30~ 60min; ? 用 PBS充分洗滌后 , 再用熒光標記的抗抗體染色 , 37℃ 30~ 60min, 洗滌 , 封固 。 ? 檢測系統(tǒng) Ag + Ab AgAb AgAb補體 + 補體 紅細胞 + 溶血素 紅 溶 指示系統(tǒng) (不溶血,陽性) 紅 溶 補體 (溶血,陰性) 4. 標記抗體技術(shù) 標記抗體技術(shù)是在抗體球蛋白分子上,連接某一個特定的、容易檢測的分子或原子 (標記物 ),利用標記抗體能與相應(yīng)抗原結(jié)合的特性,通過標記物的檢測,從而確定抗原的存在部位。 ? 間接凝集試驗 將可溶性抗原或抗體結(jié)合在一種與免疫無關(guān)的惰性微粒表面,然后與相應(yīng)的抗體或抗原作用,在有電解質(zhì)存在的適宜條件下,微粒即可被動的被凝集,出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。 熒光抗體的標記 ? (1)免疫球蛋白( IgG )的提?。?硫酸銨鹽析法、 DEAE纖維素提取法。 肝臟 胸腺 肺臟 法氏囊 腸道 脾臟 食道 ●熒光抗體技術(shù) 酶標抗體 ? 酶標抗體 是指與底物結(jié)合后能顯色的 酶 與 抗體連接后所制備
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