【正文】 害我們的細胞，這些自由 基是我們環(huán)境中（空氣、水、污染物，以及其它物質(zhì)）產(chǎn)生的。氧化張力可以嚴重地傷害我們的免疫系統(tǒng)，使身體虛弱而生病，甚至也許會威脅到我們的生命。就像金屬銹蝕或食品腐爛那樣，人體內(nèi)氧化張力引起的自由基傷害是衰老和疾病的首要因素。這些自由基在健康細胞和組織中可以引發(fā)連鎖反應(yīng)。我們生命的每時每刻，身體內(nèi)極其大量的自由基都在向細胞 “開戰(zhàn) ”，力圖破壞細胞膜與細胞核，改變基因材料。因此，花青素可能是歷史上最重大的發(fā)現(xiàn)之一。 1 材料與方法 試劑與儀器 試劑 磷酸氫二鈉 分析純 北京精求化工有限責任公司 磷酸二氫鈉 分析純 北京精求化工有限責任公司 鐵氰化鉀 分析純 長沙科迪亞實業(yè)有限公司 三氯乙酸 生化試劑 南通林港化工有限公司 三氯化鐵 生化試劑 江西省南華貿(mào)易有限 公司 碘化鉀 生化試劑 蘇州市貝斯特精細化工集團公司 雙氧水 生化試劑 蘇州市貝斯特精細化工集團公司 濃硫酸 生化試劑 江西省南華貿(mào)易有限公司 硫代硫酸鈉 生化試劑 南通林港化工有限公司 淀粉 生化試劑 蘇州市貝斯特精細化工集團公司 硫酸亞鐵 生化試劑 南通林港化工有限公司 水楊酸 生化試劑 江西省南華貿(mào)易有限公司 甲硫氨酸（ Met） 分析純 重慶賽力君安醫(yī)藥有限 公司 核黃素（ RF） 分析純 Sigma 公司 氮藍四唑 (NBT) 分析純 北京博奧森生物技術(shù)有限公司 乙二胺四乙酸 (EDTA) 分析純 上海市普飛生物技術(shù)公司 1， 1二苯基苦基苯肼 (DPPH) 分析純 Sigma 公司 器材與儀器 722 分光光度計 無錫新龍科技有限公司 電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司 離心機 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司 實驗方法 32 .還原力測定 取 1mL 一定濃度的原花青素（ 10— 1000μ g/mL）樣品加入 的磷酸鹽緩沖溶液（ ）和 1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻，在 50℃保溫 20min后取出，加入 10%的三氯乙酸，混合后離心（ 3000r/min） 10min,取上清液 加入 蒸餾水和 三氯化鐵溶液，混勻后，在波長 700nm 處測定吸光度，吸光度越大表明樣品還原能力越強。 OH的 Fenton 反應(yīng)： H2O2 + Fe2+→若在體系中加入具有清除故采用固定反應(yīng)時間法，在 510nm 處測量含被測物反應(yīng)液的吸光度，并與空 白液比較，便能測定被測物對 對超氧陰離子自由基 （ O2在 25℃ ，一定光強的熒光燈下照射 30 min 后 于 560 nm 處測定吸光度。－ 的清除率。將其充分混勻后暗處孵育 30min 后，在517nm 處測定吸光度。 對羥基自由基（?? OH）的抑制作用 35 010203040506070800 50 100 150 200 250 300 350 400 450濃度（ μ g/ml)OD值蓮房 蓮子殼 圖 23 對羥基自由基（?? OH）的抑制作用 Fig23 The hydroxyl radical (? OH) Inhibition 根據(jù)圖 23，可以看出蓮房和蓮子殼中的原花青素對羥基自由基都有一定的消除作用，且最佳消除濃度不是越高越好，蓮房的最佳濃度在 80(μ g/mL),而蓮子殼的卻在 100(μ g/mL)，這表明蓮房和蓮子殼中的原花青素存在差異。而根據(jù)與維生素 C 的抗氧化值測定的比較中，原花青素的抗氧化能力要比維生素 C 還要強，這是與一些相關(guān)報道符合的。眾所周知， 此外，原花青素的結(jié)構(gòu)單元系黃烷醇結(jié)構(gòu)， A環(huán)和 B環(huán)的酚羥基對 Fe3+ 具有較強的配位作用，從而使原花青素對羥基自由基顯示很強的清除作用。 做抗氧化試驗時，通過與維生素 C 的比較，確定了原花青素對鐵離子、羥基自由基、超氧陰離子都有作用，能夠還原鐵離子，對羥基自由基、超氧陰離子具有消除作用。 畸變 植物藥分冊 . [J]（ 5） .196203 [3]Laparra,J., Masquelier,J.(1977)Etude pharmacociique , Phytoterapie [J]11,133142 [4]中國制藥信息， 1998， 4. [5]Gupa, Haslam,E.(1981)plant from pinus of the Chemical Saiety Perkin Transactions [J] [6]Stafford,and Cheng,.(1980)The procyanidins of Doμglas fir seedlings,callus snd cell suspension cultures derived from [J]. 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Anme Marie ,No Candidatate [J]2021 [12],et al.,[J]日本公開特許公報 94 336418 [13]Dumon,M.(1990)Recherches anslytiques sur les pour le Doctorat d39。 38 第 四 章 結(jié) 論 此實驗通過利用微波輔助的方法來提取原花青素，通過單因素實驗進行正交實驗確定運用微波輔助提取原花青素的最佳工藝條件，并用重復(fù)試驗來驗證其穩(wěn)定性和可靠性。而原花青素由于具有較多的酚羥基，因此，可有效地還原羥基自由基。 原花青素的清除能力隨著濃度的增加，其清除體系中 對 DPPH 的清除作用 7075808590951000 50 100 150 200 250 300 350濃度（ μ g/mL)清除率（%）原花青素 圖 25 對 DPPH 的消除作用 Fig25 DPPH elimination of the role 維生素 DPPH 有很好的清除作用，但是其清除率隨濃度的變化不大，而原花青素在低濃度或較高濃度時的清除率都不是很高，但是如果選好濃度，如圖 25所示 原花青素 濃度在 150（μ g/mL)左右時其清除率在維生素 C 之上。 還原能力測定 34 010 200 400 600 800 1000 1200濃度（ μ g/mL)OD值 蓮房 蓮子殼 圖 22 原花青素的還原能力 Fig22 proanthocyanidins reducing ability 如（圖 22）所示蓮房中原花青素在低濃度時的還原能力比維生素 C 的，而超出一定濃度范圍之后，起還原能力就不如維生素 C 了，但是原 花青素的還原能力還是隨著濃度的遞增而增強，比較蓮房和蓮子殼中原花青素的還原能力可以發(fā)現(xiàn)，蓮房中的原花青素的花園能力明顯優(yōu)于蓮子殼中的，這可能的原因是蓮子殼中原花青素大部分是一些高聚體，不具有還原能力。－產(chǎn)生 50％清除率所需的樣品濃度（ ?g/mL），以 IC50 表示。－清除劑的體系吸光值為 A，加清除劑后的為 A1。－ ， NBT 法檢測。 表 5 反應(yīng)體系 Table 5 Reaction system Reagent/mL A0 A1 A2 FeSO4 H2O2 Salicylic acid — LSPC — 37℃反應(yīng) 30min，流水冷卻，各管分別加入 蒸餾水，使體系終體積為 ， 2 000 rpm/min 離心 10min。 OH。 OH具有很高的反應(yīng)活性，其存活時間短，但在反應(yīng)體系中加入水楊酸能有效地捕捉 分別準確稱取原花青素和 Vc 各 ，用蒸餾水溶解后定容至 200mL 容量瓶中，吸取供試液 10mL，加入 1moL/L 硫酸和 5mL ，室溫下反應(yīng) 10min 再加入 10%碘化鉀溶液 ,靜置 5min 后用 硫代硫酸鈉滴定，以 1%淀粉溶液指示終點，同時用空白對照，并與 Vc 比較，按下列公式計算 AOV 值（抗氧化值， mg/g） ,AOV 越大還原能力越強。與其它抗氧化 31 劑不同，花青素有跨越血腦屏障的能力，可以直接保護大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)。嚴重地傷害我們的免疫系統(tǒng)，使體質(zhì)虛弱、疾病纏身、危及生命。自由基很快失控，導(dǎo)致傷害人體組織和其它系統(tǒng)，包括大腦和神經(jīng)系統(tǒng)。氧自由基是失去了一個電子的含氧分子，它極不穩(wěn)定，反應(yīng)活性很高。請想象：切開的蘋果變成棕色、皮球變脆、汽車的金屬零件銹蝕、肉食腐爛發(fā)臭。體內(nèi)新陳代謝的時候，也產(chǎn)生自由基，它們是天然副產(chǎn)物。而且利用亞硫酸氫鈉溶液要比用丙酮更具有經(jīng)濟價值。 通過作原花青素的標準曲線，進行一系列單因素試驗，以及通過正交實驗進行選擇最佳的實驗條件，并用重復(fù)試驗來驗證通過正交實驗選出的最佳方案的穩(wěn)定性和可靠性。 正交試驗 表 3 水提原花青素正交試驗表 Table3 Proanthocyanidins orthogonal Table 試管號 因素 原花青素得率 微波功率 微波時間 料液比 （ mg/g) 1 1 1 1 2 1 2 2 3 1 3 3 4 2 1 2 5 2 2 3 6 2 3 1 7 3 1 3 8 3 2 1 9 3 3 2 K1 K2 K3 k1 k2 k3 運用表 表 2 的方法，以微波輸出功率、微波作用時間和料液比三個因素作為考察因素作三因素三水平正交表，如表 3。 微波萃取功率的影響 0123456780% 20% 40% 60% 80% 100% 120%微波功率得率（%)蓮房 蓮子殼 圖 12 微波輸出功率的影響 Fig12 Microwave Power Extraction of Impact 如圖 12 所示，當微波輸出功率為 80%（即 560W）時，原花青素和總酚的得率在同條件下達到最高。 萃取次數(shù)的影響 012345670 1 2 3 4 5萃取次數(shù)得率（%)原花青素 總酚 圖 8 萃取次數(shù)的影響 Fig8 Extraction number of Impact 如（圖 8）所示，當萃取次數(shù)達到 3 次以后，原花青素和總酚的得率都趨于平行，表明再做多余的萃取次 數(shù)已經(jīng)沒有必要了。 微波萃取功率的影響 01234567890% 20% 40% 60% 80% 100% 120%微波功率得率（%g)原花青素 總酚 圖 6 微波萃取功率的影響 Fig6 Microwave Power Extraction of Impact 在其它條件不變的情況下考慮通過改變微波的輸出功率對原花青素和總酚的得率的影響。 水平 因素 溶劑容度 A 萃取功率 B 萃取時間 C 料液比 D 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 2 結(jié)果與分析 標準曲線 00 吸光度值濃度(mg/mL)： 圖 1 總酚標準曲線 Fig1 Total phenol standard curve y（總酚） =+ R2 = 17 00 吸光度值濃度(mg/mL) 圖 2 原花青素含量標準曲線 Fig2 Proanthocyanidins content standard curve y（ 原花青素） = +