揚州大學現(xiàn)代分子生物學5-分子生物學研究方法-wenkub
2023-01-23 05:44:32 本頁面
【正文】 ? 電擊法 常見的 DNA操作技術(shù) 化學轉(zhuǎn)化原理： 在 0℃ 冷凍處理時，處于 CaCl 2低滲溶液中的大腸桿 菌細胞膨脹成球形。DNA連接酶 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 目的基因的來源 ? 原核細胞 ? 真核細胞： cDNA或 gDNA文庫 ? 人工合成及 PCR擴增目的基因 天然 DNA （染色體 DNA、病毒DNA(噬菌體 DNA)、質(zhì)粒 DNA、線粒體DNA和葉綠體 DNA） 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 （八）重組實驗中的主要載體 定義： 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 命名 Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 Ⅱ 類酶識別序列特點 —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 即反相重復結(jié)構(gòu)，是 DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對稱的序列。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對重組 DNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。 ? 50年代末和 60年代提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。 DNA技術(shù)誕生的理論基礎 DNA技術(shù)奠基 ? DNA分子的切割與連接技術(shù) ? 限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶 的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學家有了進行 DNA操作的基本工具。 ? Southern雜交、 DNA序列分析和聚合酶鏈反應 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 ? 重組 DNA技術(shù) (rebinant DNA technique): 是按照人們意愿，在體外對 DNA分子進行重組 ,再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該 DNA的大量拷貝。 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 ? DNA連接酶 : 通過磷酸二酯鍵把兩個或多個 DNA片斷連接成一個整體 DNA分子。 重組 DNA技術(shù)發(fā)展史 克隆載體 (cloning vector) 為使插入的外源 DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體 。 DNA可吸附于其表面。 ? 常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等 ? ?互補藍白斑篩選 ? 營養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)） 常見的 DNA操作技術(shù) ?互補篩選 常見的 DNA操作技術(shù) ? β半乳糖苷酶基因（ LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（ N端） 146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒 ? 編碼 β半乳糖苷酶羧基端（ C端）部分序列的宿主細胞 ? IPTG/Xgal的培養(yǎng)基上篩選藍白斑 藍白斑篩選 Lac Z , IPTG Xgal X + gal （白色） （藍色） Lac Z（失活） , IPTG Xgal
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