【正文】 選舉出3種方法并簡(jiǎn)述過(guò)程。典型的DNA重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？a、提取供體生物的目的基因（或稱外源基因），酶接連接到另一DNA分子上（克隆載體），形成一個(gè)新的重組DNA分子。因此RNA聚合酶難以與其結(jié)合。 方法是分成四組分別為ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反應(yīng)后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出DNA序列。 利用雙脫氧末端終止法（Sanger法）測(cè)定DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的原理與方法？原理是采用核苷酸鏈終止劑—2，3，雙脫氧核苷酸終止DNA的延長(zhǎng)。 細(xì)胞融合物中包含：脾脾融合細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，脾細(xì)胞不能體外培養(yǎng)。e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 4．舉例說(shuō)明差示篩選組織特異cDNA的方法？制備兩種細(xì)胞群體，目的基因在其中一種細(xì)胞中表達(dá)或高表達(dá)，在另一種細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，然后通過(guò)雜交對(duì)比找到目的基因。三、簡(jiǎn) 答1． 分別說(shuō)出5種以上RNA的功能？轉(zhuǎn)運(yùn)RNA tRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 ；核蛋白體RNA rRNA 核蛋白體組成成 ；信使RNA mRNA 蛋白質(zhì)合成模板 ；不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前體 ；小核RNA snRNA 參與hnRNA的剪接；小胞漿RNA scRNA/7SLRNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分；反義RNA anRNA/micRNA 對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用；核酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA2．原核生物與真核生物啟動(dòng)子的主要差別？原核生物TTGACA TATAAT起始位點(diǎn) 35 10真核生物增強(qiáng)子GC CAATTATAA—5mGpp—起始位點(diǎn) 110 70 253．對(duì)天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建：a、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇,通常是抗生素基因。24．質(zhì)粒DNA具有三種不同的構(gòu)型分別是：（ SC構(gòu)型 ）、（ oc構(gòu)型 ）、（ L構(gòu)型 ）。 側(cè)切割產(chǎn)生539。21．RNA聚合酶Ⅱ的基本轉(zhuǎn)錄因子有、TFⅡA、TFⅡB、TFIID、TFⅡE他們的結(jié)合順序是： （ D、A、B、E ）。17．雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生是由（脾B）細(xì)胞與（骨髓瘤 ）細(xì)胞雜交產(chǎn)生的，由于（脾細(xì)胞）可以利用次黃嘌呤，（ 骨細(xì)胞 ）提供細(xì)胞分裂功能，所以能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。14．PCR的反應(yīng)體系要具有以下條件：a、被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的 DNA引物（約20個(gè)堿基左右）。②將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。有G時(shí)轉(zhuǎn)錄從（ S2 ）開(kāi)始，無(wú)G時(shí)轉(zhuǎn)錄從（ S1 ）開(kāi)始。9．蛋白質(zhì)多亞基形式的優(yōu)點(diǎn)是（亞基對(duì)DNA的利用來(lái)說(shuō)是一種經(jīng)濟(jì)的方法 ）、（可以減少蛋白質(zhì)合成過(guò)程中隨機(jī)的錯(cuò)誤對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響）、（活性能夠非常有效和迅速地被打開(kāi)和被關(guān)閉 ）。5．啟動(dòng)子中的元件通?？梢苑譃閮煞N：（核心啟動(dòng)子元件 ）和（上游啟動(dòng)子元件 ）。二、填 空1． DNA的物理圖譜是DNA分子的（限制性內(nèi)切酶酶解 ）片段的排列順序。17．順式作用元件：在DNA中一段特殊的堿基序列，對(duì)基因的表達(dá)起到調(diào)控作用的基因元件。15．考斯質(zhì)粒：是經(jīng)過(guò)人工構(gòu)建的一種外源DNA載體，保留噬菌體兩端的COS區(qū)，與質(zhì)粒連接構(gòu)成。11．上游啟動(dòng)子元件：是指對(duì)啟動(dòng)子的活性起到一種調(diào)節(jié)作用的DNA序列，10區(qū)的TATA、35區(qū)的TGACA及增強(qiáng)子，弱化子等。9．弱化子：在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列。3．CAP：環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMP receptor protein ），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白CAP（cAMP activated protein ）4．回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互補(bǔ)序列，常是限制性酶切位點(diǎn)。分子生物學(xué)試題及答案一、名詞解釋1．cDNA與cccDNA：cDNA是由mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈DNA；cccDNA是游離于染色體之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA。5．micRNA：互補(bǔ)干擾RNA或稱反義RNA，與mRNA序列互補(bǔ)，可抑制mRNA的翻譯。10．魔斑：當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，遇到氨基酸全面缺乏時(shí)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，停止全部基因的表達(dá)。12．DNA探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。16．藍(lán)白斑篩選：含LacZ基因（編碼β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。18．Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除了5’ → 3’外切酶活性19．錨定PCR：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。2． RNA酶的剪切分為（自體催化 ）、（異體催化 ）兩種類型。6．分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包含（結(jié)構(gòu)分子生物學(xué) ）、（基因表達(dá)與調(diào)控 ）、（ DNA重組技術(shù) ）三部分。10．蛋白質(zhì)折疊機(jī)制首先成核理論的主要內(nèi)容包括（成核 ）、（結(jié)構(gòu)充實(shí)）、（最后重排）。12．DNA重組技術(shù)也稱為（基因克?。┗颍ǚ肿涌寺?）。③對(duì)那些吸收了重組DNA的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。b、具有熱穩(wěn)定性的酶如：TagDNA聚合酶。18．隨著研究的深入第一代抗體稱為（多克隆抗體）、第二代（單克隆抗體）、第三代（基因工程抗體 ）。其中TFIID的功能是（與TATA盒結(jié)合 ）。 粘端 ）、（在對(duì)稱軸339。在電泳中最前面的是（ SC構(gòu)型 ）。b、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。 例如：在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)與正常細(xì)胞表達(dá)水平不同的mRNA，因此，可以通過(guò)差示雜交篩選出與腫瘤相關(guān)的基因。骨骨融合細(xì)胞：不能利用次黃嘌呤，但可通過(guò)第二途 徑利用葉酸還原酶合成嘌呤。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂鍵所需要的3OH，一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。 激活蛋白（CAP）對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用？環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。 CAP的存在（功能）：能顯著提高酶與啟動(dòng)子結(jié)合常數(shù)。 b、將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。抗生素抗性篩選、抗性的插入失活、蘭白斑篩選 或PCR篩選、差式篩選、DNA探針 多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。 如pUC質(zhì)粒含LacZ基因（編碼β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。ES在無(wú)飼養(yǎng)層中培養(yǎng)時(shí)會(huì)分化為肌細(xì)胞、N細(xì)胞等多種功能細(xì)胞，在含有成纖維細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)ES將保持分化功能。2．密碼子(codon)：mRNA中堿基順序與蛋白質(zhì)中氨基酸順序的對(duì)應(yīng)關(guān)系是通過(guò)密碼實(shí)現(xiàn)的， mRNA中每三個(gè)相鄰的堿基決定一個(gè)氨基酸，這三個(gè)相鄰的堿基稱為一個(gè)密碼子。6．移碼突變(frameshift mutation)：在mRNA中，若插入或刪去一個(gè)核苷酸，就會(huì)使讀碼發(fā)錯(cuò)誤，稱為移碼，由于移碼而造成的突變、稱移碼突變。(二)問(wèn)答題1．參與蛋白質(zhì)生物合成體系的組分有哪些?它們具有什么功能?①mRNA：蛋白質(zhì)合成的模板；②tRNA：蛋白質(zhì)合成的氨基酸運(yùn)載工具；③核糖體：蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所；④輔助因子：(a)起始因子—參與蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物形成；(b)延長(zhǎng)因子—肽鏈的延伸作用；(c)釋放因子一終止肽鏈合成并從核糖體上釋放出來(lái)。 (2)密碼不重疊：組成一個(gè)密碼的三個(gè)核苷酸只代表一個(gè)氨基酸，只使用一次，不重疊使用。 (6)起始密碼子AUG，同時(shí)也代表Met，終止密碼子UAA、UAG、UGA使用頻率不同。 (3)rRNA 核糖體的組分，在形成核糖體的結(jié)構(gòu)和功能上起重要作用，它與核糖體中蛋白質(zhì)以及其它輔助因子一起提供了翻譯過(guò)程所需的全部酶活性。6．氨基酸在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中是怎樣被活化的?催化氨基酸活化的酶稱氨酰tRNA合成酶，形成氨酰tRNA，反應(yīng)分兩步進(jìn)行： (1)活化 需Mg2+和Mn2+，由ATP供能，由合成酶催化，生成氨基酸AMP酶復(fù)合物。 (2)肽鏈合成的起始：由起始因子參與，mRNA與30S小亞基、50S大亞基及起始甲酰甲硫氨酰tRNA(fMettRNAt)形成70S起始復(fù)合物，整個(gè)過(guò)程需GTP水解提供能量。8．蛋白質(zhì)合成中如何保證其翻譯的正確性?提示：(1)氨基酸與tRNA的專一結(jié)合，保證了tRNA攜帶正確的氨基酸；(2)攜帶氨基酸的tRNA對(duì)mRNA的識(shí)別，mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子的相互識(shí)別，保證了遺傳信息準(zhǔn)確無(wú)誤地轉(zhuǎn)譯；(3)起始因子及延長(zhǎng)因子的作用，起始因子保證了只有起始氨酰tRNA能進(jìn)入核糖體P位與起始密碼子結(jié)合，延伸因子的高度專一性，保證了起始tRNA攜帶的fMet不進(jìn)入肽鏈內(nèi)部；(4)核糖體三位點(diǎn)模型的E位與A位的相互影響，可以防止不正確的氨酰tRNA進(jìn)入A位，從而提高翻譯的正確性；(5)校正作用：氨酰tRNA合成酶和tRNA的校正作用；對(duì)占據(jù)核糖體A位的氨酰tRNA的校對(duì)；變異校對(duì)即基因內(nèi)校對(duì)與基因間校對(duì)等多種校正作用可以保證翻譯的正確。11．蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)是怎樣形成的? 提示：蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)是由氨基酸的順序決定的，不同的蛋白質(zhì)有不同的氨基酸順序，各自按一定的方式折疊而成該蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。利用放射性同位素標(biāo)記法，通過(guò)核糖體的分離證明之。 Val: GUU GUC GUA GUG Arg: CGU CGC CGA CG AGA AGG正常肽段的核苷酸序列為：AUG GUA UGC GU… CG…；突變體肽段的核苷酸序列為：AUG GCU AUG CGU 。DNARNA一級(jí)結(jié)構(gòu)Primary structure核苷酸序列AGTTCT 或AGUUCU 的排列順序3，5， 磷酸二酯鍵氨基酸排列順序肽鍵二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondarystructure超螺旋多條肽鏈（或不同蛋白）15. 試比較原核生物與真核生物的翻譯。氨酰tRNA __為原料直接供體，以__核糖體_____為合成楊所。5．延長(zhǎng)因子T由Tu和Ts兩個(gè)亞基組成，Tu為對(duì)熱___不穩(wěn)定___蛋白質(zhì)，Ts為對(duì)熱__ 穩(wěn)定_蛋白質(zhì)。9．原核細(xì)胞核糖體的____小___亞基上的 ___16SrRNA_______協(xié)助辨認(rèn)起始密碼子。13．原核生物的核糖體由_____30S_______小亞基和____50S________大亞基組成，真核生物核糖體由___40S______小亞基和_______60S________大亞基組成。 ①?gòu)腃→N端 ②定點(diǎn)雙向進(jìn)行 ③從N端、C端同時(shí)進(jìn)行 ④從N→C端2．不能合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器是( ③ )。 ①A、G ②C、U ③U ④U、C、A 6．蛋白質(zhì)合成所需能量來(lái)自( ③ )。 ①肽基轉(zhuǎn)移酶形成肽鍵 ②氨酰一tRNA與核糖體的“A，’位點(diǎn)結(jié)合 ③核糖體沿mRNA移動(dòng) ④fMet—tRNAf與mRNA的起始密碼子結(jié)合以及與大、小亞基的結(jié)合10．在真核細(xì)胞中肽鏈合成的終止原因是( ④ )。 ①氨基酸必須活化 ②需要消耗能量 ③每延長(zhǎng)一個(gè)氨基酸必須經(jīng)過(guò)進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位、稅落四個(gè)步驟 ④合成肽鏈由C端向N端不斷延長(zhǎng) ⑤新生肽鏈需加工才能成為活性蛋白質(zhì)15．下列哪些內(nèi)容屬于蛋白質(zhì)合成后的加工、修飾( ②③④⑤ )。端富含嘧啶的互補(bǔ)順序 ④啟動(dòng)基因的順序特征 ⑤以上都正確19.( √ )3．每—種氨基酸都有兩種以上密碼子。( )7．大腸桿菌的核糖體的大亞基必須在小亞存在時(shí)，才能與mRNA結(jié)合。( √ )11．每種氨基酸只能有一種特定的tRNA與之對(duì)應(yīng)。( √ )15．核糖體的活性中心“A”位和“P”位都主要在大亞基上。2．半保留復(fù)制(簡(jiǎn)稱復(fù)制)（semicons