【正文】 ~%，%~%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%。 [24]也利用LCMS/MS方法對(duì)來(lái)自歐洲15個(gè)國(guó)家的1500個(gè)市場(chǎng)購(gòu)買的豬肉樣品進(jìn)行四種硝基呋喃類抗生素的代謝物殘留的檢測(cè)，方法的定量限分別(AOZ、AMOZ)、(SC)、(AH)，在1500個(gè)樣品中檢測(cè)出12份樣品有代謝物殘留，并得以確證。目前許多國(guó)家已將LCMS/MS方法作為檢測(cè)硝基呋喃類抗生素的代謝物的確證性方法。但是其儀器設(shè)備的購(gòu)置和運(yùn)行費(fèi)用較高，成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。用此方法在北愛(ài)爾蘭豬呋喃唑酮?dú)埩羰录袑?duì)100個(gè)豬腎臟樣品進(jìn)行了測(cè)定，7份濃度在1~5ng/g之間，4份小于1ng/g ，還有1份達(dá)到144ng/g。Robert Kennedy[21]提出一種用HPLCUV和LCMS 方法檢測(cè)動(dòng)物性食品中硝基呋喃類抗生素呋喃唑酮。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL TDLO實(shí)驗(yàn)室建立了完整的LCMS 法檢測(cè)呋喃唑酮代謝物AOZ 及其他代謝物 [19]。對(duì)被測(cè)化合物的確認(rèn)有很高的可信度，具有靈敏度高(比UV檢測(cè)器高10倍以上)、選擇性好、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，而且HPLCMS有易于操作和自動(dòng)化的特點(diǎn)。呋喃唑酮的檢測(cè)限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測(cè)限為2ng/g。4)%~(98177。11)%~(97177。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性范圍在10~60ng/ml。（2）液相色譜電化學(xué)檢測(cè)器(LCECD)電化學(xué)檢測(cè)器(ECD) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測(cè)中得到應(yīng)用。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù)CV≤25%。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強(qiáng)紫外吸收，第一章 引 言 8 其檢測(cè)限可以達(dá)到1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會(huì)導(dǎo)致測(cè)定困難和干擾。 色譜分析方法高效液相色譜法(HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測(cè)中比較常見(jiàn)， HPLC法所用的檢測(cè)器文獻(xiàn)報(bào)道較多的有紫外檢測(cè)器(UV，包括二極管陣列檢測(cè)器DAD)和電化學(xué)檢測(cè)器(ECD) 。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測(cè)方法在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測(cè)方法的文獻(xiàn)中，早期的文獻(xiàn)報(bào)道大多數(shù)是檢測(cè)原藥化合物。此外，還容易自動(dòng)化，如自動(dòng)化的 SPE：ASPEC，為滿足不同樣品萃取量的需求，有各種不同體積的柱子可供選擇，包括碟式萃取片。LiChrolut EN 和 SDBL 柱可以提供相似的結(jié)果，但保留特性有少許差別。將含待測(cè)物的溶液通過(guò)吸附層，使待測(cè)物保留在吸附層，經(jīng)洗脫除去雜質(zhì)，再選用合適的溶劑洗脫并收集目標(biāo)分析物。液液萃取的優(yōu)點(diǎn)是成本低，不需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，其缺點(diǎn)是在萃取過(guò)程中有時(shí)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，且有機(jī)溶劑消耗量大。在實(shí)際分析中，結(jié)合多種凈化和濃縮技術(shù)來(lái)減少檢測(cè)的背景噪聲，以達(dá)到定量分析微量殘留物的應(yīng)用也很常見(jiàn)。值得注意的是，許多細(xì)胞大分子也含有可反應(yīng)的氨基，需加入遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量的2NBA 來(lái)確保由蛋白結(jié)合殘留釋放出的自由代謝產(chǎn)物全部衍生化。以呋喃唑酮為例，肌肉組織在酸性條件下被水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 AOZ與 2NBA 發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成性質(zhì)穩(wěn)定的衍生物，該衍生物有紫外吸收，并可儲(chǔ)存于18 ℃ 冰箱內(nèi)數(shù)周不變。 水解和衍生化對(duì)于硝基呋喃代謝物的測(cè)定，鑒于其殘留物主要以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在，只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下經(jīng)水解過(guò)程，才能釋放出游離代謝產(chǎn)物，而且因殘留物的濃度一般非常低，需要采用衍生化手段提高靈敏度，故樣品的處理需要水解和衍生化。 提取和衍生化 溶劑提取在樣品的提取步驟，要求能夠?qū)?dòng)物性食品中的硝基呋喃殘留物釋放至溶液中，一般使用水和酸化的有機(jī)溶劑，以達(dá)到去除大部分蛋白質(zhì)和萃取殘留物的目的。 樣品的均質(zhì) 取樣時(shí)，通常僅取可食部分，并注意具有代表性。養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)當(dāng)建立養(yǎng)殖檔案，載明飼料、飼料添加劑等投入品和獸藥的來(lái)源、名稱、使用對(duì)象、時(shí)間和用量等有關(guān)情況，禁止使用硝基呋喃等違禁藥物。加強(qiáng)對(duì)飼料生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)控，嚴(yán)禁使用農(nóng)業(yè)部規(guī)定以外的獸藥作為飼料添加劑。要廣泛宣傳畜禽健康養(yǎng)殖知識(shí)、國(guó)家安全用藥的有關(guān)法律法規(guī)和藥物殘留對(duì)人類健康的危害性，讓廣大養(yǎng)殖者了解使用禁用藥后產(chǎn)生的危害及法律后果，提高養(yǎng)殖者的法律意識(shí)和安全用藥的自覺(jué)性。我國(guó)目前使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SN0530－1996 出口肉品中呋喃唑酮?dú)埩袅繖z驗(yàn)方法:液相色譜法，檢測(cè)限量 [45]。美國(guó) 規(guī)定：食源性動(dòng)物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因。由于對(duì)呋喃唑酮蛋白結(jié)合態(tài)殘留物的安全性產(chǎn)生懷疑，自 1995 年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)，在動(dòng)物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。動(dòng)物肝臟為主要的藥物代謝器官，蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)的殘留藥物主要累積在肝臟。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝迅速，代謝第一章 引 言 2 的部分化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，從而延緩藥物在體內(nèi)的消除速度。呋喃它酮為強(qiáng)致癌性藥物，呋喃唑酮具中等強(qiáng)度致癌性。大劑量或長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用硝基呋喃類藥物均能對(duì)畜禽產(chǎn)生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小，為呋喃西林的1/10左右。呋喃唑酮用于羅氏沼蝦、鰻鱺、對(duì)蝦和河蟹等水生動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境的消毒藥物。圖11 四種硝基呋喃代謝物結(jié)構(gòu)式第一章 引 言 1 這類抗生素因其具有抑菌性和殺菌性而廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療，部分品種具有促生長(zhǎng)的作用，可用作飼料添加劑。目 錄 I 動(dòng) 物 組 織 中 硝 基 呋 喃 代 謝 物 殘 留 量 的 測(cè) 定 方 法畢 業(yè) 論 文第 一 章 目 錄摘 要 .......................................................................................................... IABSTRACT（英文摘要） ............................................................................ Ⅱ 目 錄 .......................................................................................................... Ⅲ第一章 引 言 ............................................................................................. 1 硝基呋喃類藥物的性質(zhì)和使用 ..................................................................... 1 硝基呋喃類藥物的危害及其管理對(duì)策 ......................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 主 要 危 害 ..................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 管 理 對(duì) 策 ..................................................... 3 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的樣品處理方法 ............................................. 4 樣 品 的 均 質(zhì) ............................................................................... 4 提 取 和 衍 生 化 ........................................................................... 5 溶 劑 提 取 ............................................................................. 5 水 解 和 衍 生 化 ...................................................................... 5 樣 品 的 凈 化 ............................................................................... 6 液 液 萃 取 （ LLP） ............................................................... 6 基 體 固 相 分 散 技 術(shù) （ MSPD） ............................................. 6 固 相 萃 取 技 術(shù) （ SPE） ........................................................ 7 在 線 透 析 和 微 量 富 集 技 術(shù) ................................................... 7 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測(cè)方法 ..................................................... 8 色 譜 分 析 方 法 ........................................................................... 8 高 效 液 相 色 譜 法 (HPLC) .................................................... 8 聯(lián) 用 技 術(shù) 分 析 法 .................................................................. 10 分 光 光 度 法 ............................................................................... 12 免 疫 分 析 法 （ IA） .................................................................... 13目 錄 II 總 結(jié) .......................................................................................... 14第二章 實(shí)驗(yàn)方法 ......................................................................................... 17 原理 ................................................................................................................ 17 儀器和設(shè)備 .................................................................................................... 17 試劑與溶液 .................................................................................................... 18 主 要 試 劑 .................................................................................. 18 主 要 溶 液 的 配 制 ...................................................................... 18 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì) 和 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ............................................................... 19 實(shí)驗(yàn)方法 ........................................................................................................ 20 試 樣 制 備 與 保 存 ...................................................................... 20 分 析 步 驟 .................................................................................. 20 洗 樣 .................................................................................... 20 水 解 .................................................................................... 20 提 取 和 凈 化 ......................................................................... 20 儀 器 參 數(shù) 與 設(shè) 定 ...........