【正文】 ~%，%~%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%。 [24]也利用LCMS/MS方法對來自歐洲15個國家的1500個市場購買的豬肉樣品進行四種硝基呋喃類抗生素的代謝物殘留的檢測，方法的定量限分別(AOZ、AMOZ)、(SC)、(AH)，在1500個樣品中檢測出12份樣品有代謝物殘留，并得以確證。目前許多國家已將LCMS/MS方法作為檢測硝基呋喃類抗生素的代謝物的確證性方法。但是其儀器設(shè)備的購置和運行費用較高，成為常規(guī)分析方法尚有一定距離。用此方法在北愛爾蘭豬呋喃唑酮殘留事件中對100個豬腎臟樣品進行了測定，7份濃度在1~5ng/g之間，4份小于1ng/g ，還有1份達(dá)到144ng/g。Robert Kennedy[21]提出一種用HPLCUV和LCMS 方法檢測動物性食品中硝基呋喃類抗生素呋喃唑酮。荷蘭瓦郝尼罕RIKIL TDLO實驗室建立了完整的LCMS 法檢測呋喃唑酮代謝物AOZ 及其他代謝物 [19]。對被測化合物的確認(rèn)有很高的可信度，具有靈敏度高(比UV檢測器高10倍以上)、選擇性好、精密度高等優(yōu)點，而且HPLCMS有易于操作和自動化的特點。呋喃唑酮的檢測限為1ng/g，鹽酸呋喃它酮的檢測限為2ng/g。4)%~(98177。11)%~(97177。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，線性范圍在10~60ng/ml。（2）液相色譜電化學(xué)檢測器(LCECD)電化學(xué)檢測器(ECD) 因其高靈敏性也在硝基呋喃類抗生素的檢測中得到應(yīng)用。本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV≤10%，批間變異系數(shù)CV≤25%。經(jīng)衍生化試劑衍生化后，產(chǎn)生強紫外吸收，第一章 引 言 8 其檢測限可以達(dá)到1μg/kg，但是復(fù)雜的基質(zhì)會導(dǎo)致測定困難和干擾。 色譜分析方法高效液相色譜法(HPLC)在硝基呋喃類抗生素的檢測中比較常見， HPLC法所用的檢測器文獻報道較多的有紫外檢測器(UV，包括二極管陣列檢測器DAD)和電化學(xué)檢測器(ECD) 。 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法在國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表有關(guān)硝基呋喃類抗生素的殘留檢測方法的文獻中，早期的文獻報道大多數(shù)是檢測原藥化合物。此外，還容易自動化，如自動化的 SPE：ASPEC，為滿足不同樣品萃取量的需求，有各種不同體積的柱子可供選擇，包括碟式萃取片。LiChrolut EN 和 SDBL 柱可以提供相似的結(jié)果，但保留特性有少許差別。將含待測物的溶液通過吸附層，使待測物保留在吸附層，經(jīng)洗脫除去雜質(zhì)，再選用合適的溶劑洗脫并收集目標(biāo)分析物。液液萃取的優(yōu)點是成本低，不需要特殊的實驗設(shè)備，其缺點是在萃取過程中有時產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，且有機溶劑消耗量大。在實際分析中，結(jié)合多種凈化和濃縮技術(shù)來減少檢測的背景噪聲，以達(dá)到定量分析微量殘留物的應(yīng)用也很常見。值得注意的是，許多細(xì)胞大分子也含有可反應(yīng)的氨基，需加入遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的2NBA 來確保由蛋白結(jié)合殘留釋放出的自由代謝產(chǎn)物全部衍生化。以呋喃唑酮為例，肌肉組織在酸性條件下被水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 AOZ與 2NBA 發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成性質(zhì)穩(wěn)定的衍生物，該衍生物有紫外吸收，并可儲存于18 ℃ 冰箱內(nèi)數(shù)周不變。 水解和衍生化對于硝基呋喃代謝物的測定，鑒于其殘留物主要以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在，只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下經(jīng)水解過程，才能釋放出游離代謝產(chǎn)物，而且因殘留物的濃度一般非常低，需要采用衍生化手段提高靈敏度，故樣品的處理需要水解和衍生化。 提取和衍生化 溶劑提取在樣品的提取步驟，要求能夠?qū)游镄允称分械南趸秽珰埩粑镝尫胖寥芤褐校话闶褂盟退峄挠袡C溶劑，以達(dá)到去除大部分蛋白質(zhì)和萃取殘留物的目的。 樣品的均質(zhì) 取樣時，通常僅取可食部分，并注意具有代表性。養(yǎng)殖場應(yīng)當(dāng)建立養(yǎng)殖檔案，載明飼料、飼料添加劑等投入品和獸藥的來源、名稱、使用對象、時間和用量等有關(guān)情況，禁止使用硝基呋喃等違禁藥物。加強對飼料生產(chǎn)企業(yè)的監(jiān)控，嚴(yán)禁使用農(nóng)業(yè)部規(guī)定以外的獸藥作為飼料添加劑。要廣泛宣傳畜禽健康養(yǎng)殖知識、國家安全用藥的有關(guān)法律法規(guī)和藥物殘留對人類健康的危害性，讓廣大養(yǎng)殖者了解使用禁用藥后產(chǎn)生的危害及法律后果，提高養(yǎng)殖者的法律意識和安全用藥的自覺性。我國目前使用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SN0530－1996 出口肉品中呋喃唑酮殘留量檢驗方法:液相色譜法，檢測限量 [45]。美國 規(guī)定：食源性動物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因。由于對呋喃唑酮蛋白結(jié)合態(tài)殘留物的安全性產(chǎn)生懷疑，自 1995 年起歐盟全面規(guī)定禁止使用呋喃類抗菌物質(zhì)，在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。動物肝臟為主要的藥物代謝器官，蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)的殘留藥物主要累積在肝臟。硝基呋喃類藥物在體內(nèi)代謝迅速，代謝第一章 引 言 2 的部分化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長期保持穩(wěn)定，從而延緩藥物在體內(nèi)的消除速度。呋喃它酮為強致癌性藥物，呋喃唑酮具中等強度致癌性。大劑量或長時間應(yīng)用硝基呋喃類藥物均能對畜禽產(chǎn)生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小，為呋喃西林的1/10左右。呋喃唑酮用于羅氏沼蝦、鰻鱺、對蝦和河蟹等水生動物養(yǎng)殖環(huán)境的消毒藥物。圖11 四種硝基呋喃代謝物結(jié)構(gòu)式第一章 引 言 1 這類抗生素因其具有抑菌性和殺菌性而廣泛用于家禽、家畜、水產(chǎn)、蜂等動物傳染病的預(yù)防與治療，部分品種具有促生長的作用，可用作飼料添加劑。目 錄 I 動 物 組 織 中 硝 基 呋 喃 代 謝 物 殘 留 量 的 測 定 方 法畢 業(yè) 論 文第 一 章 目 錄摘 要 .......................................................................................................... IABSTRACT（英文摘要） ............................................................................ Ⅱ 目 錄 .......................................................................................................... Ⅲ第一章 引 言 ............................................................................................. 1 硝基呋喃類藥物的性質(zhì)和使用 ..................................................................... 1 硝基呋喃類藥物的危害及其管理對策 ......................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 主 要 危 害 ..................................................... 2 硝 基 呋 喃 類 藥 物 的 管 理 對 策 ..................................................... 3 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的樣品處理方法 ............................................. 4 樣 品 的 均 質(zhì) ............................................................................... 4 提 取 和 衍 生 化 ........................................................................... 5 溶 劑 提 取 ............................................................................. 5 水 解 和 衍 生 化 ...................................................................... 5 樣 品 的 凈 化 ............................................................................... 6 液 液 萃 取 （ LLP） ............................................................... 6 基 體 固 相 分 散 技 術(shù) （ MSPD） ............................................. 6 固 相 萃 取 技 術(shù) （ SPE） ........................................................ 7 在 線 透 析 和 微 量 富 集 技 術(shù) ................................................... 7 硝基呋喃類物質(zhì)及其代謝物的檢測方法 ..................................................... 8 色 譜 分 析 方 法 ........................................................................... 8 高 效 液 相 色 譜 法 (HPLC) .................................................... 8 聯(lián) 用 技 術(shù) 分 析 法 .................................................................. 10 分 光 光 度 法 ............................................................................... 12 免 疫 分 析 法 （ IA） .................................................................... 13目 錄 II 總 結(jié) .......................................................................................... 14第二章 實驗方法 ......................................................................................... 17 原理 ................................................................................................................ 17 儀器和設(shè)備 .................................................................................................... 17 試劑與溶液 .................................................................................................... 18 主 要 試 劑 .................................................................................. 18 主 要 溶 液 的 配 制 ...................................................................... 18 標(biāo) 準(zhǔn) 物 質(zhì) 和 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 ............................................................... 19 實驗方法 ........................................................................................................ 20 試 樣 制 備 與 保 存 ...................................................................... 20 分 析 步 驟 .................................................................................. 20 洗 樣 .................................................................................... 20 水 解 .................................................................................... 20 提 取 和 凈 化 ......................................................................... 20 儀 器 參 數(shù) 與 設(shè) 定 ...........