【正文】 ...................................................... 21 液 相 色 譜 串 聯(lián) 質(zhì) 譜 測(cè) 定 ..................................................... 22 定 性 方 法 ............................................................................. 22 定 量 方 法 ............................................................................. 23第三章 結(jié)果計(jì)算及討論 ............................................................................... 24 結(jié)果計(jì)算 ........................................................................................................ 24 總離子流圖和保留時(shí)間 ................................................................................ 24 樣品衍生條件的優(yōu)化 .................................................................................... 25 凈化條件的選擇 ............................................................................................ 26 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 ............................................................................................. 26 檢測(cè)限、測(cè)定低限、回收率和精密度 ......................................................... 29 回 收 率 統(tǒng) 計(jì) .............................................................................. 29 重 復(fù) 性 統(tǒng) 計(jì) .............................................................................. 33 內(nèi)標(biāo)法定量 .................................................................................................... 38 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜及線性范圍 ............................................................................ 39目 錄 III 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 圖 譜 .......................................................................... 39 線 性 范 圍 .................................................................................. 41 質(zhì)量控制及注意事項(xiàng) .................................................................................... 41 質(zhì) 量 控 制 .................................................................................. 41 注 意 事 項(xiàng) .................................................................................. 42結(jié)論 ............................................................................................................. 44參考文獻(xiàn) ...................................................................................................... 45致謝及聲明 .................................................................................................. 48 目 錄 IV 第一章 引 言 0 第一章 引 言 硝基呋喃類藥物的性質(zhì)和使用硝基呋喃類藥物(Nitrofurans)是人工合成的具有5硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌、某些真菌和原蟲(chóng)均有作用，在低濃度下對(duì)上述病原體有抑制作用，高濃度則有殺滅作用，其抗菌作用機(jī)理是干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng)，使細(xì)菌代謝紊亂 [1]。呋喃類藥物內(nèi)服后，吸收較少，吸收的部分在體內(nèi)迅速被破壞，血藥濃度低，不易達(dá)到有效濃度，不宜用于全身感染的治療。呋喃唑酮用于防治畜禽腸道感染，如兔球蟲(chóng)病、豬痢疾、禽白痢、火雞黑頭病等 [2]。在硝基呋喃類藥物中，以呋喃西林對(duì)家禽的毒性作用最常見(jiàn)，尤其是雛鴨和雛雞，以220mg/kg混飼喂雛鴨或以400mg/kg混飼喂雛雞，連續(xù)用藥10天以上，出現(xiàn)呆滯、羽毛蓬松、厭食或興奮、驚厥癥狀，最后死亡。通過(guò)對(duì)小白鼠和大白鼠的毒性研究表明，呋喃唑酮可以誘發(fā)乳腺癌和支氣管癌，并且有劑量反應(yīng)關(guān)系；高劑量飼喂食用魚(yú)和觀賞魚(yú)，可誘導(dǎo)魚(yú)的肝臟發(fā)生腫瘤；繁殖毒性結(jié)果表明，呋喃唑酮能減少精子的數(shù)量和胚胎的成活率。用呋喃唑酮對(duì)種雞進(jìn)行處理以后，代謝物殘留將按種雞種蛋 雛雞成雞的生物鏈條傳遞。 硝基呋喃類藥物的管理對(duì)策由于硝基呋喃類藥物殘留危害嚴(yán)重，美國(guó)、日本和歐盟等國(guó)家和地區(qū)紛紛采取措施，嚴(yán)加監(jiān)管。歐盟(EU)N0807/2022 法規(guī)中，規(guī)定使用 HPLC 方法檢測(cè)呋喃唑酮，檢測(cè)限量 2ng/kg~4ng/kg。韓國(guó) 2022 年版《食品公典》規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮。2022 年開(kāi)始，我國(guó)將硝基呋喃納入殘留監(jiān)控計(jì)劃中。（2）加強(qiáng)獸藥生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)管理。飼料生產(chǎn)企業(yè)要加強(qiáng)對(duì)生產(chǎn)原料的管理，做到原料來(lái)源清楚，記錄明確；要加強(qiáng)對(duì)原料檢測(cè)，重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)魚(yú)粉原料的檢測(cè)；要防止含有硝基呋喃類藥物的飼料原料投入生產(chǎn)，防止在生產(chǎn)過(guò)程中污染違禁藥物。（5）加強(qiáng)獸藥殘留監(jiān)控。對(duì)于蝦類樣品的處理，先粉碎均勻，再冷凍儲(chǔ)存，但對(duì)其他肌肉組織、腎臟和肝臟等樣品，需要先冷第一章 引 言 4 凍，后選擇有代表性部分切成薄片，再進(jìn)一步粉碎。在樣品的提取和去蛋白過(guò)程中，有機(jī)溶劑也能從內(nèi)源性大分子中萃取非共價(jià)鍵結(jié)合的殘留物。通常水解選用稀鹽酸，濃度為 。同樣地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白結(jié)合代謝物，經(jīng)酸水解，產(chǎn)生游離代謝產(chǎn)物 SEM、 AMOZ 和 AHD。 樣品的凈化通常，得到的水提取液或有機(jī)提取液中，目標(biāo)分析物濃度較低，還含有許多共萃取基質(zhì)，如果這些物質(zhì)在最終的溶液中存在，不僅會(huì)干擾檢測(cè)，也會(huì)增加背景噪聲，無(wú)法測(cè)定痕量濃度的目標(biāo)分析物。 液液萃取（LLP ）液液萃取是最經(jīng)典、常用的凈化手段，可以用有機(jī)溶劑將待測(cè)物從溶液中萃取出來(lái)，或者將干擾物質(zhì)從有機(jī)相或水相萃取物中除去。 基體固相分散技術(shù) （MSPD）基體固相分散技術(shù)是將硅藻土或非極性的 C18 衍生硅膠等作為吸附劑，加第一章 引 言 6 入到樣品中，混合均勻，或者樣品與吸附劑一同研磨，然后把攪拌均勻的物質(zhì)填充到層析柱中，用溶劑淋洗，達(dá)到凈化的目的，該技術(shù)可以克服液液萃取過(guò)程中產(chǎn)生乳化的問(wèn)題。用固相萃取柱可以從共萃取物中凈化和濃縮硝基呋喃萃取物。其他可供選擇的柱還有如 Waters Oasis HLB SPE、Varian Bond Elut ENV/LMS、Supelco Supelclean EnviChrom P、JT Baker Bakernond H2Ophobic DVB、 IST Isolute101 等。此外，高通量的 96 孔板，可滿足處理大量樣品的要求。然而由于硝基呋喃類抗生素對(duì)光敏感，具有代謝快速的特點(diǎn)，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期不過(guò)數(shù)小時(shí)，通常不太可能檢出原藥的殘留，例如呋喃唑酮在停藥后12h內(nèi)從組織中消失，而其代謝物3氨基2惡唑烷酮(AOZ)在動(dòng)物體內(nèi)則以組織蛋白結(jié)合物的形式存在，在體內(nèi)可殘留數(shù)周，在停藥后至少6周內(nèi)AOZ在豬肌肉組織中繼續(xù)存在 [10]，因此當(dāng)原藥濃度降至檢測(cè)限以下時(shí)，檢測(cè)其代謝物濃度是可能的。近年來(lái)各種色譜聯(lián)用技術(shù)分析法在硝基呋喃類抗生素的代謝物的檢測(cè)中應(yīng)用較多，發(fā)展迅速，主要是與質(zhì)譜聯(lián)用（包括串聯(lián)質(zhì)譜）。Angelini [12]利用LCUV 方法檢測(cè)牛肌肉組織中四種硝基呋喃類藥物的殘留，方法的檢測(cè)限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。葛寶坤等 [13]采用固相萃取(SPE)前處理凈化技術(shù)，高效液相色譜(配有紫外檢測(cè)器) 法快速測(cè)定雞肉、魚(yú)、蝦中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮藥物殘留量，4種硝基呋喃類藥物在雞肉、魚(yú)、蝦樣品中3個(gè)不同水平的添加回收率(n=7) 為87%~102%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)%~%；工作曲線的線性范圍為5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的檢出限分別為2μg/kg 。Owen [15]利用LCECD( 工作電極為玻碳電極，工作 ，參比電極為Ag/AgCl電極)檢測(cè)用含有呋喃唑酮的飼料喂養(yǎng)的雞的肝臟和胸部肌肉組織中的呋喃唑酮的殘留。其中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因測(cè)定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r分別為第一章 引 言 9 、(Height) 、 (Area)。9)% 、(87177。9)%。 聯(lián)用技術(shù)分析法（1）液相色譜質(zhì)譜法(LCMS)色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于多組分混合物的分離和分析，特別適合有機(jī)化合物的定量分析，但定性較困難；質(zhì)譜儀只能夠?qū)我唤M分提供高靈敏度和特征的質(zhì)譜圖，但對(duì)復(fù)雜化合物分析無(wú)能為力。LCMS 法可以利用待測(cè)分子的結(jié)構(gòu)來(lái)定性，可以排除酶聯(lián)免疫方法和HPLC法檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果，用以確證檢測(cè)結(jié)果。HorneE 等進(jìn)一步對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，利用 SPE簡(jiǎn)化了衍生后的呋喃唑酮代謝物NPAOZ的提取過(guò)程，再用LCMS 法進(jìn)行定性分析，對(duì)檢測(cè)豬肝中呋喃唑酮代謝物AOZ的不同方法進(jìn)行比較研究，表明利用HPLC法和LCMS法測(cè)定 AOZ的結(jié)果基本相同 [20]。在溶解提取物用鋁土柱凈化后，用HPLCUV篩選可能含有呋喃唑酮的樣品，LCMS 方法用來(lái)確定證實(shí)陽(yáng)性樣品。目前，HPLC、LCMS 相關(guān)聯(lián)的NPAOZ 提取方法已經(jīng)得到改良，并通過(guò)一系列的加標(biāo)樣品研究得以驗(yàn)證。（2）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)最近幾年用于檢測(cè)硝基呋喃類抗生素的代謝物的LCMS/MS方法發(fā)展迅速，它是一種靈敏度更高、選擇性更好、特異性更強(qiáng)的一種方法，歐盟目前認(rèn)為HPLCMS只能用于對(duì)硝基呋喃代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，對(duì)檢出的陽(yáng)性結(jié)果必須再用LCMS/MS 進(jìn)行確證。Alexander Leitner等 [23]提出用LCMS/MS方法同時(shí)分析動(dòng)物肌肉組織中四種硝基呋喃類抗生素的代謝物的方法。Pascal Mottier等 [25]利用LCMS/MS方法，電噴霧電離(ESI) ，內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)肉中4種硝基呋喃類抗生素的代謝物，~，~，低于歐盟規(guī)定的1μg/kg 的最低檢測(cè)限量的要求。余建新等 [26]采用微量化樣品前處理技術(shù)，以鄰硝基苯甲醛為衍生劑，電噴霧正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式建立了蜂蜜及水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類抗生素代謝物殘留量同時(shí)測(cè)定的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)方法。廖峰等 [27]利用分光光度法測(cè)定飼料中的呋喃唑酮，這種方法是將飼料試樣中的呋喃唑酮用二甲基甲酰胺(DMF)提取出來(lái)，使其與苯肼鹽酸溶液反應(yīng)，產(chǎn)生亮黃色的反應(yīng)物，再用甲苯萃取后，在440nm處用分光光度計(jì)讀取其吸光值，從而進(jìn)行測(cè)定。 免疫分析法（IA）國(guó)內(nèi)外關(guān)于硝基呋喃類抗生素的免疫分析方法的報(bào)道很少。)%，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，呋喃唑酮的抗血清與呋喃西林的交叉反應(yīng)性為43%，與其他藥物未顯示免疫交叉反應(yīng)性。其原理是：將被測(cè)樣本中的結(jié)合代謝殘留物經(jīng)水解、衍生形成NPAOZ，其與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的NPAOZ競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限的NPAOZ抗體(競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析)，同時(shí)此抗體又與包被在微孔板條上針對(duì)它的抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的NPAOZ后，加入酶反應(yīng)底物和生色劑到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。根據(jù)試劑空白A450值由校準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)濃度，以其 3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差乘以前處理稀釋倍數(shù)2分別作為檢測(cè)限(LOD)和定量檢測(cè)限(LOQ)，得到相應(yīng)的試劑空白對(duì)應(yīng)的濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD；檢測(cè)限(LOD) ；定量檢測(cè)限(LOQ)；②方法回收率和精密度。不同的添加水平，得到相應(yīng)的平均回收率和變異系數(shù)RSD；④交叉反