基因轉(zhuǎn)染技術(shù)ppt課件-wenkub
2023-05-27 07:53:52 本頁面
【正文】 418篩選， 4－ 5天細(xì)胞開始死亡， 2周后出現(xiàn)陽性細(xì)胞的克隆增殖， 4－ 5周后可以挑克隆鑒定 、 微粒子轟擊法（基因槍） 在真空狀態(tài)下，利用粒子加速器將外面包裹了外源基因 DNA的金顆?；蜴u粉微顆粒進(jìn)行加速，打入完整的細(xì)胞中，從而使外源基因 DNA得以在靶細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化并有可能獲得表達(dá)。 電脈沖和場強(qiáng)的優(yōu)化 對于成功的轉(zhuǎn)染很重要。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒 DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細(xì)胞表面的受體所識別。促進(jìn)因子通常是在 DNA磷酸鈣共沉淀物被細(xì)胞吸收4～ 8小時(shí)之后再加入。該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低。 基因轉(zhuǎn)染方法 轉(zhuǎn)染 通過生化或者物理方法將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞中 。LOGO 分子生物學(xué)技術(shù)在藥理中的應(yīng)用 基因轉(zhuǎn)染技術(shù) 主要內(nèi)容 概 述 1 基因運(yùn)載系統(tǒng) 轉(zhuǎn)染的基本過程 外源基因的表達(dá)和檢測 2 3 4 5 主 要 應(yīng) 用 一 、 概述 ?基因轉(zhuǎn)染的定義：將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能。 方法分類 感染 通過病毒介導(dǎo)，用基因組中攜帶有克隆目的片斷的病毒來感染靶細(xì)胞。 影響因素： （ 1） DNA磷酸鈣共沉淀物中DNA的數(shù)量（ 2）共沉淀物與細(xì)胞接觸的保溫時(shí)間（ 3）甘油或 DMSO等促進(jìn)因子作用的持續(xù)時(shí)間等。 、 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 脂質(zhì)體能 在體內(nèi)或體外 提供運(yùn)載外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。 如若將 DNA在體內(nèi)運(yùn)送至肝內(nèi)，可以選去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)系統(tǒng) (肝 . 實(shí)質(zhì)細(xì)胞 ) 和 甘露糖受體介導(dǎo)系統(tǒng) (肝 .非實(shí)質(zhì)細(xì)胞 ) 、 聚陽離子受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染過程 、 顯微注射法 在顯微鏡下，將 DNA經(jīng)同細(xì)胞玻璃針直接注入細(xì)胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長的細(xì)胞，但需要一定的設(shè)備和操作技巧。 在高壓電場的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生臨時(shí)性破裂形成微孔 微孔的關(guān)閉：一種天然衰減的過程，在 0℃ 下，這種過程會被延緩進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。 、 精子載體法 用精子和 NDA（吡啶核甘酸輔酶 ） 劑孵育，可捕獲得 DNA。其主要缺點(diǎn)是病毒載體對外源基因的最大容納量只有 2500bp。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有 CMV和 SV。 病毒載體轉(zhuǎn)染過程 三、轉(zhuǎn)染的基本過程 轉(zhuǎn)染與分析 靶基因質(zhì)粒 DNA的準(zhǔn)備 靶細(xì)胞的準(zhǔn)備 、 被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。 DNA的質(zhì)量和純度能影響某些細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率，可以通過 CsCl梯度法或標(biāo)準(zhǔn)柱層析法進(jìn)行純化。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同
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