雙向凝膠電泳ppt課件-wenkub
2023-05-27 06:39:48 本頁面
【正文】 度在堿性區(qū)不穩(wěn)定（陰極漂移）、重復(fù)性不易掌握和上樣量低是其主要缺點，并且一般不能分離等電點大于 ，其優(yōu)點是電泳設(shè)備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展工作，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可達(dá)到非常高的分辨率，也可獲得好的重復(fù)性，目前唯一分辨到 10000個蛋白質(zhì)斑點的圖譜正是采用了這一系統(tǒng)。 第二向是將在 IPG 膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量 (MW) 大小與第一向相垂直的分離。當(dāng)?shù)鞍讛U散到低于其等電點 pH 區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動 。 雙向凝膠電泳的基本原理 先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點在 pH 梯度膠內(nèi)進行等電聚焦，然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進行 SDSPAGE 第二次電泳分離。 同年， 2D PAGE在原理上又有了新的發(fā)展，以第一向為蛋白質(zhì)等電聚焦的雙向凝膠電泳技術(shù)建立起來，即 IEFPAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 6168； Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by bined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppeseyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917919)。第五章 雙向凝膠電泳 (2DPAGE) 蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)路線 雙向凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展及原理 儀器簡介 樣品制備 技術(shù)流程 1. 蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)路線 ? 要求 ? 流程 ? 技術(shù)路線 蛋白質(zhì)組分析的首要要求 將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進行分離、檢測和分析 。 20世紀(jì) 70年代初，在第二向電泳中又使用了十二烷基磺酸鈉 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of nonhistone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165170； Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403405； Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die geische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向電泳基本上根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量來分離，從而奠定了現(xiàn)代雙向凝膠電泳的基礎(chǔ)，即 IEFSDS PAGE。 第一向進行等電聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性 ， 將蛋白質(zhì)樣品加載至 pH梯度介質(zhì)上進行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動 。 同樣 ， 如果蛋白質(zhì)擴散到高于其等電點的 pH 區(qū)域時，則帶負(fù)電，在電場的作用下會向陽極移動。沿垂直的方向進行 SDSPAGE 電泳，按分子量大小進行分離。 NEPHGE為非平衡 pH梯度電泳 (nonequilibrium pH gradient electrophoresis)，是 IPG (immobilized pH gradient) 膠發(fā)明前用于分離堿性蛋白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中達(dá)到平衡前結(jié)束電泳，第一向的 pH也是依靠載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦，之后用8M尿素 + 5%β ME + 2%SDS進行平衡，再進行第二向 SDSPAGE電泳。 雙向電泳的分類 3. 儀器簡介 第一向： 采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺；最大電壓為 10, 000伏；有不同的電壓上升方式；可分步進行時間或電壓 第二向： BIORAD公司 PROTEAN II xi Cell電泳槽： 電極是直徑為 ；適用于 20cm 凝膠電泳；凝膠厚度為 ；可同時運行 12塊膠；上槽緩沖溶液 350ml，下槽緩沖溶液 L；典型 SDSPAGE電泳時間：無冷卻時為 5小時，帶冷卻時為 。 Amersham pharmcia Biotech公司 Hoefet miniVE electrophoresis and electrotransfer Unit： 膠大小為 8cm 。 ? 防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。 現(xiàn)常用預(yù)分級＋窄 pH膠的微制備技術(shù)進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群 ，再用 pH梯度小于 2個 pH單位的 IPG膠進行窄 pH范圍的分離 。 至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下 ， 蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽 ， 或者可能是大分子 。 ? 溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度一般穩(wěn)定在 20℃ ，太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會造成膠上的蛋白質(zhì)點位置的變化。 ? 重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進行，此時樣品已經(jīng)
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