【正文】 對培養(yǎng)基的要求高 (需要 12 種必需氨基酸 、 8種以上的維生素 、多種 無機鹽 和 微量元素 、作為主要 碳源的 葡萄糖 ，以及多種 細胞生長因 子 和 貼附因子 ，而且不同種類要求又有變化。不是嚴(yán)格定量，核酸可引起強干擾作用。如質(zhì)譜 ? 基因工程藥物 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常需多種檢測方法 ? 兩者雜質(zhì)性質(zhì)差別較大。 ? 外源蛋白的穩(wěn)定性： 采用融合蛋白形式表達； 采用蛋白酶缺陷的突變菌株 真核細胞表達的特點及選擇 ? 常用的真核表達系統(tǒng) ： 酵母表達系統(tǒng) 、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)的比較 大腸桿菌 巴斯德畢赤酵母 載體 原核載體 穿梭載體 調(diào)控序列 原核 原核和真核 表達形式 包涵體、融合蛋白、分泌 分泌 翻譯后修飾 基本無 有 生產(chǎn)方式 發(fā)酵，操作簡 單、經(jīng)濟 發(fā)酵，操作較簡單、較經(jīng)濟 ★ 酵母表達體系的影響因素 ? 外源基因的結(jié)構(gòu) ? 外源基因 5’ 端非翻譯區(qū)的序列和長度影響 mRNA 的翻譯效率 ? 起始密碼子兩側(cè)若容易形成 RNA 二級結(jié)構(gòu)，將阻止翻譯進行 ? 富含 AT 序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止 ? 密碼子的偏好性 ? 高度復(fù)雜的胱氨酸結(jié)構(gòu)基序影響表達效率 ? 表達形式及信號肽的選擇 ：無信號肽常胞內(nèi)表達；有信號肽，胞外分泌型表達 ? 啟動子 ：多數(shù)畢赤酵母采用乙醇氧化酶 AOX AOX2 啟動子 ? 轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù) ：拷貝數(shù)越高，表達水平也越高 ? 誘導(dǎo)條件 ：甲醇誘導(dǎo)的濃度、時間以及溫度的選擇 ? 外源蛋白 的降解 ：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或調(diào)節(jié) pH 值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白的穩(wěn)定性。 小于 100bp 的片段：直接合成，最常用固相亞磷酸三酯法 。 DNA 聚合酶、 RNA 聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ： 5’→ 3’DNA 聚合酶活性； 5’→ 3’DNA 外切酶活性； 3’ → 5’ DNA 外切酶活性； RNA H 酶活性 ? Klenow 酶：不具備 5’ → 3’ DNA 外切酶活性 ? T4 噬菌體 DNA 聚合酶：不具備 5’→ 3’ DNA 外切酶活性。在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型細菌菌株制備質(zhì)粒 DNA。 ? 酶切反應(yīng)的溫度 ? DNA 的分子結(jié)構(gòu) ? 反應(yīng)緩沖 液組成 ? 反應(yīng)時間、反應(yīng)體積等 ? 工具酶 ? 核酸限制性內(nèi)切酶 ： 識別、水解外源的雙鏈 DNA 分子上特定的核苷酸序列。外切酶活性比 Klenow 酶強 200 倍，對單鏈 DNA 作用強于雙鏈 DNA ? T7噬菌體 DNA 聚合酶：不具備 5’→ 3’DNA 外切酶活性 ? Taq DNA 聚合酶 ? 反轉(zhuǎn)錄酶：催化以 RNA 或 DNA 為模板，合成 DNA；具有 RNA H 酶的活性 ? 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：催化 dNTP 沿 5’→ 3’聚合，逐個加于線性 DNA 分子的 3’ 末端 ； 不需要模板 ? 載體 ： (vector)來源于質(zhì)粒、噬菌體或病毒的 DNA 分子 ，可 供插入或克隆目的基因 或 DNA，并具有運載外源 DNA 導(dǎo)入宿主細胞的能力。 大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法 ? PCR 法 ： 前提：已知待擴增目的基因或 DNA 片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙引物。 ? 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) ? 表達載體：病毒載體 (腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等 )；質(zhì)粒載體 ? 表達方式：瞬時表達、穩(wěn)定表達、誘導(dǎo)表達 ? 基因 重組 蛋白的主要分離技術(shù) ：離心、沉淀 (等電點沉淀法、鹽析法 )、膜分離、雙水相萃取 ? 基因重組蛋白的主要純化技術(shù)： 離子交換層析 、 親和層析 、 凝膠過濾層析 、 反相色譜和疏水色譜 ? 選擇分離純化方法的依據(jù) ? 根據(jù)表達形式選擇 ? 分泌型：沉淀和超濾 ? 周質(zhì)表達：溶菌酶處理＋滲透壓休克 ? 胞內(nèi)可溶表達：親和層析或離 子交換層析 ? 胞內(nèi)不溶表達 (包涵體 )：易與雜蛋白分開，但需要復(fù)性形成有活性的蛋白質(zhì)。小分子藥物雜質(zhì)主要來源于合成中原料殘留、合成副產(chǎn)物和純化中溶劑殘留；基因工程藥物多為宿主蛋白殘留和宿主基因殘留，其檢測一般都用專用的試劑盒。 ? BCA 法 ： 堿性條件與 Cu2＋ 絡(luò)合同時將 Cu 2＋ 還原成 Cu＋ (雙縮脲反應(yīng) )，再與二辛可寧酸形成紫色復(fù)合物，在 562nm 有最大 吸收值。 ) 6) 動物細胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細菌不同 培養(yǎng)條件要求高、成本貴，產(chǎn)量低 ； 多半是分泌在胞外的 ，收集純化方便，得到了 較完善的翻譯后修飾 ★ 動物細胞培養(yǎng)的條件 (一 )環(huán)境條件： 直接接觸的器材 、 防止污染 (顯著地污染標(biāo)志： pH 值迅速改變，細胞外形模糊，甚至出現(xiàn)細胞集落 )、水質(zhì)、 pH(大多是 )、 滲透壓 、 溫度 、 通氧量 、 基本營養(yǎng)物質(zhì) (二 )營養(yǎng)要求：水、碳源、氮源、維生素、激素、無機鹽等 ? 碳源不能為無機物，大多只能利用葡萄糖 ? 氮源不能為無機物，主要利用 各種氨基酸 ? 在多數(shù)情況下，需要添加 5％－ 20％的小牛血清，或適量動物胚胎浸出液。腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，桿狀病毒載體 昆蟲細胞系統(tǒng) ? 基因工程細胞主要的篩選系統(tǒng)， ① HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶 )選擇系統(tǒng)，篩選 tk+、 hgprt+的轉(zhuǎn)化細胞 ② GPT(HAT、黃嘌呤、甘氨酸、霉酚酸 )選擇系統(tǒng)，篩選 gpt+的轉(zhuǎn)化細胞 ③ G418(Geicin)選擇系統(tǒng)，篩選 Neor的轉(zhuǎn)化細胞 ④ MTX 選擇系統(tǒng)，篩選 dhfr+的轉(zhuǎn)化細胞 細胞庫的建立： 原始細胞庫 (MCR)→生產(chǎn)用細胞庫 (MWCR，又稱工作細胞庫，主細胞庫→生產(chǎn)細胞庫 ) 常用生產(chǎn)用動物細胞 ： BHK21， C127 細胞， CHOK1， COS 細胞， MDCK 細胞， WI38， MRC5， Namalwa，Sf9， Vero， SP2/0Ag14 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) ★ 動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法 ? 懸浮培養(yǎng) ： 適用于 非貼壁依賴細胞或兼性貼壁細胞 優(yōu)點： 操作簡便，培養(yǎng)條件均一，傳質(zhì)傳 氧較好，容易擴大培養(yǎng)，可以借鑒細菌培養(yǎng)的經(jīng)驗。理想的微載體應(yīng)具備：生物相容性、無毒性、表面惰性、比重適當(dāng) (~ )、粒徑均一，在 60~250?m 之間 (溶脹后 )、光學(xué)透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復(fù)多次使用、制備簡單、原料充分 ? 多孔載體培養(yǎng) ： 可用于 懸浮細胞 及 貼壁細胞。 ② 生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)、傳熱和混合性能好。 ⑥ 容器加工制造時要求內(nèi)面 光滑，無死角。 轉(zhuǎn)基因動物 基本原理及步驟： 外源目的基因的制備 → 外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細胞或胚胎干細胞 → 選擇獲得攜有目的基因的細胞 → 選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物 → 轉(zhuǎn)基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定 → 篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物品系 轉(zhuǎn)基因動物制作方法 ? 經(jīng)典的技術(shù)路線 ： 基因 顯微注射法 ，最常用、成功的方法，成功率低 ? 整合胚胎移植的技術(shù)路線： 受精卵的成活率高達 90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率 ? 核移植 (克隆 )的技術(shù)路線： 體細胞核移植；核移植前導(dǎo)入目的基因。 如 :免疫血清 (含多種特異性抗體 ) 實際意義：預(yù)防 、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清 (抗破傷風(fēng) )；胎盤球蛋白 (抗病毒感染 )。 均一性好 ： 其 H 鏈、 L 鏈及 V 區(qū)獨特性其完全一致，所得到的抗體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性狀完全一致?？勺儏^(qū)中的其它部分變化較小，稱為 骨架區(qū) (FR) ? C 區(qū)決定 Ig 分子的異種抗原性，主要發(fā)揮抗體分子的效應(yīng)功能。在體外條件下做 大規(guī)模培養(yǎng) /注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖 。 影響細胞 DNA 的合成 ： H促進了次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT)途徑； T 促進了胸腺嘧啶激酶 (TK)途徑；內(nèi)源性途徑 (谷氨酰胺、鳥核苷酸單磷酸，二氫葉酸還原酶途徑 )被 A(葉酸的拮抗物 )阻斷 步驟： 融合后細胞→ HAT 培養(yǎng)基→ HT 培養(yǎng)基→正常培養(yǎng)基 ? 雜交瘤細胞的檢測和克隆 抗體的檢測 ：僅少數(shù)雜交瘤細胞可以分泌預(yù)期抗體。 ELISA、間接免疫熒光法 ? McAb 類和亞類的鑒定 ：類的鑒定一般在 雜交瘤的克隆化過程中可以確定 (兔抗鼠 IgG 或 IgM 作為二抗用于 ELISA)亞類的確定需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)做雙擴散電泳或夾心 ELISA。 1/3 ? Fv 片段： 由 VH 與 VL 非共價結(jié)合而成。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。在 scFv 的 C 端 /N 端插入其他靶向信號 ? 最小識別單位： 約為完整分子的 1/801/70 大小，一般由一個 CDR 構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性 噬菌體抗體工程 噬菌體抗體庫技術(shù)的三個關(guān)鍵 ： RTPCR 技術(shù)；噬菌體展示技術(shù)；抗體原核表達技術(shù) 。這類菌 (疫 )苗有 卡介菌 (預(yù)防結(jié)核病的菌苗 )、 炭疽菌苗 、 牛痘疫苗 、狂犬病疫苗、 鼠疫菌苗 、 脊髓灰質(zhì)炎疫苗 以及 麻疹苗 等。 活載體疫苗 ? 利用低致病力的 痘病毒、皰疹病毒、腺病毒或細菌 作為載體，將 其它病原的主要保護性抗原基因插入到載體基因組的非必需區(qū)形成新的重組體，在同源或兼容性好的啟動子驅(qū)動下隨載體的復(fù)制表達插入的外源基因。 強毒種的選育： 毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種 ，最后凍干保藏。 烷化 DNA 分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，妨礙 RNA 的合成 。 ? 病毒的保護劑 ① 5%蔗糖脫脂乳； ②馬立克 814 活細胞疫苗：保存液氮 .穩(wěn)定劑為 10%二甲基亞砜和 50%犢牛血清的 199 液。 酶的分類 ： 六大類， 氧化還原酶類 (脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、羥化酶以及加氧酶類 )、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類 (淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶 )、裂解酶類 (醛縮酶、水化酶及脫氨酶 )、異構(gòu)酶類 (消旋酶、順反異構(gòu)酶 )和 合成酶類 (又稱為連接酶 ) 酶的來源和生產(chǎn) ： 直接從動植物獲得，即從生物體中分離和提純；化學(xué)合成方法；工業(yè)微生物發(fā)酵 發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點 ：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全。同時考慮原料的來源、取材方便經(jīng)濟等方面因素 ? 細胞破碎 ：機械法、物理法、化學(xué)法 (有機溶劑、表面活性劑 )、生物法 (酶解 ) ? 保護措施： 采用緩沖系統(tǒng)；添加保護劑；抑制水解酶的作用；其他：注意溫度、攪拌、紫外光等的影響 ? 酶的抽提： ? 目標(biāo)： 將目的酶最大限度地溶解出來；保持生物活性。產(chǎn)物中混雜酶蛋白，分離純化困難。適于催化小分子物質(zhì)。 (2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用。固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。 ? 固定化酶的表觀米氏常數(shù) Km 的變化 ：固定化酶的表觀 Km 隨載體的帶電性能變化。其特點是：底物與酶一次性投入反應(yīng)器內(nèi)，產(chǎn)物一次性取出；反應(yīng)完成之后，固定化酶 (細胞 )用過濾法或超濾法回收，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。 ? 優(yōu)點是：在理想狀況下，混合良好，各部分組成相同，并與輸出成分一致。 ? 優(yōu)點是：高效率、易操作、結(jié)構(gòu)簡單等，因而， PBR 是目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最為普遍的反應(yīng)器。 ? 流化床反應(yīng)器 ? 流化床反應(yīng)器 (Fluidized Bed Reactor, FBR)。 ? 膜反應(yīng)器 ? 膜反應(yīng)器 (membrane reactor, MR)是將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器。常用的是中空纖維反 應(yīng)器。 流化床 分批式 、 流加分批式 連續(xù)式 固定化酶 流化床反應(yīng)器具有混合均勻，傳質(zhì)和傳熱效果好，溫度和 pH值的調(diào)節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對粘度較大反應(yīng)液也可進行催化反應(yīng)。 ? 方法 ：交聯(lián)修飾 (交聯(lián)法 )；定點突變與化學(xué)修飾相結(jié)合；小分子修飾 (酶蛋白側(cè)鏈基團修飾 )；大分子修飾 (大分子結(jié)合修飾 )；輔因子的引入 ? 應(yīng)用 ：如： PEG－超氧化物 歧化酶 (SOD)、 PEG－溶血類蛋白質(zhì) (鏈激酶、尿激酶等 )、 PEG－天門冬酰胺酶(ASNase)—— 消除了抗原性，延長了酶在體內(nèi)的半衰期。 沙土管保藏法 ： 4℃、無氧、干燥、低溫和無營養(yǎng)條件 保藏， 110y。 冷凍真空干燥保藏法 ： 515y，適于各類微生物 液氮超低溫保藏法 ： 196℃， 15y，適于各類微生物 宿主保藏法 ： 被感染的宿主 一同低溫保藏 。通常到對數(shù)期生長，菌體量未達最高峰時。常采用 單罐深層培養(yǎng)法 。缺陷：損失菌體和營養(yǎng)物質(zhì)；造成發(fā)酵液稀釋，不利于下游工藝；造成前體丟失，影響產(chǎn)量；染雜菌 ? 連續(xù)培養(yǎng) ： 在發(fā)酵過程中某一時段，一邊連續(xù)補充培養(yǎng)液，一邊以相同流速放出發(fā)酵液，維持原有發(fā)酵體積。通過糖量測定，間接推測產(chǎn)物生物合成效率。 原則：上述指標(biāo)高，成本低 ? 生產(chǎn)率＝ kg 產(chǎn)物 /[發(fā)酵液體積 (L)〃 h]；得率 =kg 產(chǎn)物 /kg 基質(zhì)；發(fā)酵系數(shù) =kg 產(chǎn)物 /罐容積 m3〃 h 基因工程菌的發(fā)酵 ? 特點： 基因工程菌培養(yǎng)過程中具有不穩(wěn)定性。 ? 初級代謝產(chǎn)物在不同的微生物中基本相同 ,而次級代謝產(chǎn)物的種類在不同微生物中是 非常不同的。后者是在微生物生長到一定時期， 以初級代謝產(chǎn)物為前提物質(zhì)而合成對微生物生命活動無明確功能性質(zhì)的過程中 所產(chǎn)生的