【正文】 植株再生（6）轉(zhuǎn)基因植株鑒定 植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)（1）愈傷組織再生系統(tǒng) （2）直接分化再生系統(tǒng) （3）原生質(zhì)體再生系統(tǒng) （4）胚狀體再生系統(tǒng) （5）生殖細(xì)胞受體系統(tǒng) 植物轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記基因? 須具備4個(gè)條件：– ① 編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；– ② 基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；– ③ 能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；– ④ 檢測(cè)容易，并能定量分析。（2）mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR? Liang Peng等人于1992年創(chuàng)立。（1）文庫扣除雜交法? 當(dāng)某個(gè)或者某些基因在這兩種不同的組織之間存在著差異表達(dá)時(shí)，利用其中一種組織中所有表達(dá)的cDNA為探針，篩選出在兩種不同組織中差異表達(dá)的基因。? 根據(jù)基因的表達(dá)變化克隆基因，是基因克隆方法創(chuàng)新最為活躍的一個(gè)領(lǐng)域，利用基因表達(dá)差異發(fā)展起來的基因克隆方法達(dá)到了數(shù)十種之多。– ④對(duì)基因片段進(jìn)行功能互補(bǔ)分析、序列測(cè)定和基因結(jié)構(gòu)鑒定。在利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫（包括YAC、BAC、TAC、PAC或cosmid文庫），從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，– 再利用此物理圖譜，通過染色體步移（chromosome walking）逐步逼近目的基因，或通過染色體登陸（Chromosome landing）方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證目的基因的功能。? 如果在某一種生物體中該基因已經(jīng)被克隆，也可以利用這些保守區(qū)段的核苷酸為探針來篩選cDNA文庫。? 以氨基酸序列為基礎(chǔ)的基因克隆方法是最為經(jīng)典的方法。 （5）植物cDNA文庫構(gòu)建– 克隆載體：主要是質(zhì)粒及λ噬菌體。⑤轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選。（3）構(gòu)建基因文庫的基本程序①植物DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。（2）基因組文庫與cDNA文庫– 基因組文庫：將某生物的全部基因組DNA切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段克隆到某種載體上而形成的集合。– ③對(duì)于復(fù)雜的染色體DNA分子來說，單個(gè)基因所占比例十分微小。– 某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落(或噬菌斑，或成活細(xì)胞) 即為一個(gè)DNA片段的克隆。? 細(xì)菌人工染色體（BAC），穿梭細(xì)菌人工染色體（BIBAC）。(3) Cosmid載體? 結(jié)合了λ噬菌體載體和大腸桿菌質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)，本身片段小，但裝載能力大，可插入1545kb，? 可用于基因組文庫的構(gòu)建。目前已有上百種，如常用的pUC18/19。 ⑤分子量小，多拷貝，易于操作。l 載體的基本條件： ①含有1個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)，供外源DNA片段的插入到載體上。用途：①同聚物加尾；②3＇末端標(biāo)記。不能催化單鏈DNA的連接。（6）DNA連接酶、RNA連接酶? DNA連接酶連接雙鏈DNA。因引物而異，一般引物50～60℃最佳。引物濃度10～50mmol/L。（4）TaqDNA聚合酶l 影響TaqDNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的主要因素：– ①模板DNA濃度。（4）TaqDNA聚合酶? 從極度嗜熱的嗜熱水生菌Thermus aquaticus中獲得，能在94℃高溫環(huán)境中存活3小時(shí)以上。（3）T7 DNA聚合酶? 持續(xù)合成能力強(qiáng)，催化合成的DNA片段比其它聚合酶催化合成的長(zhǎng)得多。④DNA測(cè)序。②用于DNA序列分析。④DNA甲基化分析。④其它因素。③在同一菌株分離獲得的不同內(nèi)切酶按照分離時(shí)間的先后，以羅馬數(shù)字加以標(biāo)注，如HindI、HindⅡ、HindⅢ。（2）命名和分類①利用屬名的第1個(gè)字母和種名的前2個(gè)字母代表內(nèi)切酶的來源。 限制性內(nèi)切核酸酶? 主要有 I 型、Ⅱ型、Ⅲ型。? 一般又可分為– 結(jié)構(gòu)基因 (structure gene)：編碼蛋白質(zhì)（或RNA）– 調(diào)控基因 (control gene)：調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。– 也含有獨(dú)立于核基因組以外的基因組，稱為線粒體基因組，其DNA稱為線粒體基因組DNA（mtDNA）。 葉綠體基因組– 葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所，– 葉綠體中含有獨(dú)立于核基因組以外的葉綠體基因組，稱為cpDNA。– 廣義的基因組還包括葉綠體基因組和線粒體基因組。– 可以跨越天然物種屏障，把來自任何一種生物的基因?qū)氲叫碌纳镏?，?shí)現(xiàn)不同生物的基因重組或基因轉(zhuǎn)移，達(dá)到對(duì)某種生物個(gè)別性狀遺傳改良的目的。– 是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心和支柱。核基因組– 是指維持生物體完整生命功能所必須的1組染色體或配子體（性細(xì)胞）所包含的全部DNA序列（nDNA）。– 一個(gè)植物葉片細(xì)胞通常含有數(shù)百個(gè)葉綠體，– 一個(gè)葉綠體中含2080個(gè)cpDNA拷貝。– 植物的線粒體基因組比動(dòng)物要大得多。? 通常指結(jié)構(gòu)基因。? Ⅱ型運(yùn)用最廣泛，I型和Ⅲ型應(yīng)用極少。例如，來自大腸桿菌(Escherichia coli)的內(nèi)切酶用Eco來命名，來自流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）的用Hin表示。（3）影響因素①DNA的濃度和質(zhì)量最關(guān)鍵的因素。（4）應(yīng)用①構(gòu)建重組的DNA分子。 DNA聚合酶? 作用： 將脫氧核糖核酸連續(xù)地連接到雙鏈DNA分子的3180。? Klenow酶的主要用途：①DNA放射性標(biāo)記。（2）T4 DNA聚合酶? 具有5＇→3＇DNA聚合活性和3＇→5＇外切核酸酶活性。? 具有很強(qiáng)的3‘→5’外切核酸酶活性，為Klenow酶的1000倍。? 具有DNA聚合酶活性和5‘→3’外切核酸酶活性。25μl的反應(yīng)體系中10～50ng雙鏈DNA。– ③Mg2＋濃度。– ⑤緩沖液；– ⑥TaqDNA聚合酶的濃度和用量。? 已知的有2種（大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶）。? 單鏈DNA或RNA的連接可使用T4 RNA連接酶。? 堿性磷酸化酶: 將5＇末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)換為OH，即脫磷酸作用。 ②能進(jìn)行自我復(fù)制，或外源DNA片段能夠整合到染色體上，隨染色體而進(jìn)行復(fù)制。 基因克隆的載體? 載體種類：– 質(zhì)粒載體– 噬菌體載體（包括以噬菌體和質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的Cosmid載體）– 人工染色體載體（YAC、BAC、PAC、TAC）(1) 質(zhì)粒載體? 質(zhì)粒是存在于宿主細(xì)胞染色體外的一種裸露的雙鏈DNA分子。(2) λ噬菌體載體? λ噬菌體是以大腸桿菌為宿主的病毒，具有極高的感染能力，能夠?qū)Ｒ恍缘闹亟M整合到大腸桿菌的染色體上，以原噬菌體的形式長(zhǎng)期潛伏在大腸桿菌中。(4) 噬菌粒(Phagemid)載體? 也是在λ噬菌體載體和大腸桿菌質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。? P1人工染色體（PAC），可轉(zhuǎn)基因人工染色體（TAC）。– 全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。要想從龐大的基因組中將其分離出來，一般需要先進(jìn)行擴(kuò)增，所以需要構(gòu)建基因文庫。根據(jù)DNA來源，又有核基因組文庫、葉綠體基因組文庫及線粒體基因組文庫。②載體的選擇及制備。（4）基因組文庫必須符合以下要求：– a）能夠覆蓋整個(gè)基因組。– 步驟：? ①細(xì)胞總RNA提取，并分離純化出mRNA；? ②合成cDNA第一鏈；? ③將mRNADNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA；? ④雙鏈cDNA重組到載體上。? 通過對(duì)表達(dá)的或者差異表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的序列進(jìn)行測(cè)定分析，獲得該蛋白質(zhì)的一段氨基酸的序列?；蛘呃眠@個(gè)引物與基因的5＇和3＇端的特殊引物配對(duì)，進(jìn)行RACEPCR擴(kuò)增克隆基因的全長(zhǎng)。? 基本步驟：– ①通過遺傳分析，將目的基因定位在染色體的一定區(qū)間內(nèi)，或在目的基因兩側(cè)獲得若干連鎖的分子標(biāo)記。 差示克隆? 植物生長(zhǎng)發(fā)育及抵抗外界各種因素的侵害等過程，是基因的精密調(diào)控過程。 差示克隆（1）文庫扣除雜交法（2）mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（differential display reverse transcript PCR，DDRTPCR）（3）抑制消減雜交法(suppression subtractive hybridization，SSH)（4）代表性差異顯示法（representational difference analysis，DNA）（1）文庫扣除雜交法? 差異表達(dá)基因克隆的最經(jīng)典方法。? 利用其中一個(gè)組織中所有表達(dá)的cDNA為探針，分別與兩個(gè)不同的cDNA文庫進(jìn)行雜交，雜交以后的斑點(diǎn)在兩個(gè)不同的文庫中存在著差異。? 主要用于比較兩個(gè)或者多個(gè)不同組織之間基因表達(dá)差異的一種快速而又簡(jiǎn)單的方法。? 最常用的是抗生素抗性基因和編碼催化人工底物形成熒光物質(zhì)的酶基因。用卡那霉素（Kanamycin）、新霉素作為選擇性物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，可對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選。 (3) GUS基因 ? 即β葡萄糖苷酸酶基因 。? GUS基因被廣泛使用于植物基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，尤其是在進(jìn)行外源基因瞬間表達(dá)系統(tǒng)中。? Luc基因檢測(cè)十分迅速，高靈敏度，具有作為報(bào)告基因的最佳條件。物理方法有基因槍法、電激法、超聲波法、顯微注射法、激光微束法等。（2）基因槍法 又稱生物彈法、微粒槍法、微粒轟擊法，是依賴高速金屬微粒將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的一種轉(zhuǎn)化技術(shù)。（4）PEG法 將原生質(zhì)體懸浮于含有質(zhì)粒DNA的PEG溶液中，通過PEG的作用，使質(zhì)粒DNA加入原生質(zhì)體，隨機(jī)整合細(xì)胞的基因組中。? 發(fā)根農(nóng)桿菌（A. rhizogenes）含有Ri質(zhì)粒? 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒有一段TDNA，農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，可將TDNA插入植物基因組中。(2) Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建共整合載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)(3) 目的基因轉(zhuǎn)化與抗性植株的再生①無菌受體材料選擇– 子葉、胚軸、葉片、莖段等都可作為受體材料。– ～，按1%～2%比例轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中， 180r/min恒溫?fù)u床上27℃ 培養(yǎng)6h左右，～，或同時(shí)加入100～500μmol/L的AS。具體時(shí)間依植物不同而異。– 不定芽長(zhǎng)到1cm以上時(shí)，切下不定芽，轉(zhuǎn)入含選擇壓的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。盡量選用幼年的外植體。幾點(diǎn)注意事項(xiàng)? 5) 外植體在菌液中的浸泡時(shí)間：太短，農(nóng)桿菌尚未接種到傷口面，不能轉(zhuǎn)化；太長(zhǎng)，外植體常因農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐。? 8) 培養(yǎng)基中抗生素篩選劑量因外植體不用而異。主要表現(xiàn)在：– (1) 篩選劑影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖及分化；– (2) 關(guān)于選擇標(biāo)記基因?qū)】岛铜h(huán)境的影響問題尚沒有定論，影響轉(zhuǎn)基因植物投入市場(chǎng)；– (3) 由于現(xiàn)有可利用的選擇標(biāo)記基因有限，應(yīng)用相同的選擇標(biāo)記基因向植物疊加外源基因存在一定的困難。– 不同轉(zhuǎn)化載體中的轉(zhuǎn)基因共整合頻率往往較低，且常整合在同一位點(diǎn)，造成基因連鎖，使得共轉(zhuǎn)化的應(yīng)用受到了限制。 （1）無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的獲得? 3）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)– 通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入的基因可以在基因組中重新定位。 （2）安全標(biāo)記轉(zhuǎn)基因的獲得? 使用安全標(biāo)記基因作選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理：不將非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死，而是轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠借助熒光顯微鏡活體檢測(cè)，或在一定程度上使轉(zhuǎn)化細(xì)胞處于某個(gè)有利的代謝條件下，從而篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。? 這類標(biāo)記基因的編碼產(chǎn)物是某種糖類的分解代謝酶，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能利用篩選劑糖類作為主要碳源，可在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則處于饑餓狀態(tài)，生長(zhǎng)被抑制但不被殺死，依此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。（2）對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，即– Southern印跡雜交證明外源基因在植物染色體的整合，– Southern原位雜交證明外源基因在染色體賞的整合位點(diǎn)，– Northern印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄，生成特異mRNA，– Western印跡雜交證明外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄及翻譯生產(chǎn)特異蛋白質(zhì)。? PCR的原理：利用DNA聚合酶能夠以引物3’OH為起點(diǎn)，催化dNTP按模板順序，合成互補(bǔ)鏈。②退火(annealling)：溫度突然降到引物Tm值以下時(shí)，引物與模板DNA互補(bǔ)序列雜交。目的片段以2n形式積累，經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)后，目的片段的DNA量可達(dá)到106倍。也可采用較簡(jiǎn)單有效的方法得到引物，即以目的基因5′端20個(gè)堿基序列做5′引物，以該基因3′端20個(gè)堿基順序的互補(bǔ)序列做3′端引物（被檢基因的序列已知）。– 此法主要用于PCR大量快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)設(shè)置兩個(gè)空白對(duì)照即無D