【正文】 但是CytP450卻在24～28h活性減少50％左右。此系統(tǒng)的優(yōu)點是保持了細胞之間的結(jié)構(gòu)，其操作也比臟器灌流容易。 (二) 臟器切片 肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。如用大鼠，則在麻醉下切腹分離一段小腸，在保持原有血液循環(huán)體系下，將腸兩端插管，清洗凈腸中內(nèi)容物，在恒溫環(huán)境中灌入灌流液。一般是以下腔靜脈和門靜脈為插管灌流通路，為此應(yīng)結(jié)扎肝動脈、上腔靜脈，在恒溫條件下灌流。②體外毒性試驗難以預(yù)測慢性毒性。它需要更好的工具——預(yù)測性毒物代謝動力學來解決，其關(guān)鍵在于發(fā)展有生理學基礎(chǔ)的毒物代謝動力學模型。但毒理學試驗的目的是關(guān)心人類健康，目前主要是將動物試驗結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。表121 體外毒性試驗系統(tǒng)的優(yōu)點能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細胞，細胞器等試驗間的誤差較少可同時和／或反復(fù)多次取樣可做成復(fù)雜的互相作用的試驗系統(tǒng)，如復(fù)合細胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細胞減少整體動物的使用 其中特別值得一提的優(yōu)點是體外試驗的簡便和易于利用人體細胞。 (二) 基本原理 體外試驗的基本原理是所觀察到的毒理學效應(yīng)均是毒物和／或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細胞上或敏感細胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。②附加試驗。在有些情況下，例如新工業(yè)品或日用化學品的開發(fā)，必須決定一種新化學物的接觸安全限量。所以體外試驗在毒理學研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導地位的趨勢。解決此種問題的重要方向是體外試驗。但是，在毒理學研究中整體試驗研究的觀點仍占主導地位。第十二章 體外試驗與生物新技術(shù) 在毒理學中的應(yīng)用第一節(jié) 體外試驗 毒性試驗的目的在于獲取一定的數(shù)據(jù)，為社會需要的外源化學物的安全使用做出判斷。目前，此種觀點已發(fā)生變化，因為：①全世界每年約有千種以上的新化合物作為商品進入人類的環(huán)境。②現(xiàn)有的整體動物毒性試驗方法需消耗大量的時間和昂貴的經(jīng)費，而體外試驗則可節(jié)省時間和經(jīng)費。但也需指出，體外試驗的發(fā)展，并不排斥體內(nèi)試驗本身的重要性，兩者必須相互補充、相互驗證才能為毒理學研究提供堅實的科學基礎(chǔ)。了解體外毒性試驗在上述毒理學決策過程中有何意義，對于評價體外毒性試驗在毒理學中的地位極有幫助。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機理的研究，但僅有它是不夠充分的。如將敏感細胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學物對其的影響，即將毒理學中毒物中毒的啟動階段，在體外條件下，觀察其對外源化合物的反應(yīng)和外源化學物對它的作用。體外毒性試驗結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學物毒理學資料所需的時間，最終可以縮短從新化學物的合成到產(chǎn)品進人市場的時間過程。在體外試驗中，利用人體細胞組織進行試驗，可較好地解決物種差異的問題。另一方面，體外毒性試驗中缺乏毒理學反應(yīng)的調(diào)控因素，如細胞與組織的修復(fù)過程和免疫系統(tǒng)的不同類型細胞間的相互影響等。因為，慢性毒性病理過程的機理所知甚少，缺乏發(fā)展體外試驗的理論依據(jù)，再者，某些體外系統(tǒng)仍難以達到長期維持生理狀態(tài)的要求。有報道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氫取代衍生物三氯甲烷與二氯甲烷對肝臟毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著灌流時間延長(在4h之內(nèi))，灌流液的上清液中K+、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SCPT)、山梨醇脫氫酶(SDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)增加，說明三種化合物對肝細胞均有損傷，而以四氯化碳為最，且依氯原子被氫取代肝毒減低。例如有人研究鋅的吸收及其影響因素，以大鼠回腸段為標本，證實鋅吸收呈二室模型(腸腔為Ⅰ室、腸粘膜為Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加腸腔與腸粘膜之間鋅的交換，且加速向血流的清除過程。例如，腦片和心肌條等是將組織片置于恒溫的孵育液中進行有關(guān)試驗研究，但需注意切片中的細胞需保持完好的細胞基質(zhì)和細胞之間的交流。不足之處是切片內(nèi)的細胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達細胞內(nèi)。據(jù)報道人肝細胞中CytP450活性穩(wěn)定性比大鼠強。在體外試驗表現(xiàn)毒性較低的化學物有環(huán)已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和長春新堿(vincristine)等。 3. 淋巴細胞 多用小動脈脾臟分離淋巴細胞或進一步分離T、B淋巴細胞進行免疫毒理研究。 5. 心肌細胞 心肌細胞用于毒理學研究的報道目前還較少。當在培養(yǎng)液中加入10μmol／L氯化鎘之后，B型通道開放時間縮短1／％、通道開放概率下降55％，％、％、通道開放概率下降50％，而對T型通道無影響。 1. 腎細胞 由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細胞株系用于毒理學研究。 近年國內(nèi)利用300次傳代培養(yǎng)的LLC—PKl細胞系對鉛的腎毒進行了研究，包括鉛對細胞的損傷、對細胞膜脂流動性的影響、對細胞膜相變溫度的影響、脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、胞內(nèi)鈣濃度變化及形態(tài)學改變等，這對鉛的腎臟毒性機理提供了依據(jù)。如人胚肺二倍體細胞在107～108mol／L苯并(a)芘長達28～38代傳代培養(yǎng)下，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)細胞核外形不規(guī)則、核膜深陷、出現(xiàn)細橋(tiny bridge)伴分葉核形成、核內(nèi)胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細胞癌變特征。利用勻漿為標本主要是研究外源化學物對細胞酶系統(tǒng)的毒理作用。現(xiàn)雖然不少工作已為其它技術(shù)所取代，但是應(yīng)用勻漿作為過篩與初步研究還是有用的，主要因其制備方法簡單、制備周期很短，且不需復(fù)雜的設(shè)備。 1. 細胞膜 人與動物紅細胞分離后低滲溶血，高速低溫離心可制得紅細胞膜(或稱血影，ghost)。 以紅細胞膜為例，／L鉛作用僅5min，紅細胞膜遠紫外色譜就出現(xiàn)改變，表明膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化。所謂人工膜，即是以正常細胞膜的膜脂組分，人工合成后用之在—定介質(zhì)中形成人工膜。據(jù)報道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗中，對線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。此類研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對純化酶作用的體征、性質(zhì)和機理進行研究，如細胞色素P450重組系統(tǒng)。 文獻中早已證明有機磷化合物的主要靶酶是AChE。體外系統(tǒng)分離的細胞包括懸浮液中的新鮮游離細胞、原代培養(yǎng)細胞、細胞株、細胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細胞。 表122 體外系統(tǒng)——細胞在毒理學中應(yīng)用的優(yōu)、缺點 優(yōu)點 改善效率，減少費用 使用實驗動物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學物濃度及接觸時間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實驗體系重復(fù)取樣 缺點 缺少整個器官的形態(tài)學觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。故細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4℃)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(—20℃)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風機，驅(qū)動空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^工作臺面，使工作部位構(gòu)成無菌環(huán)境。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。主要的塑料瓶皿有；①多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細胞或單個細胞克隆的生長；②培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細胞轉(zhuǎn)化等試驗；③培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；④其它：凍存細胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有200~1000μ1和1μl~100μl二種。如有需要可配置貯存器和運輸瓶。 實驗室應(yīng)配備自動加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點。 9. 濾過消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒。 酸度計，用于準確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。 培養(yǎng)液在制備過程中應(yīng)嚴格操作，避免混入雜質(zhì)。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細胞的溶液。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 如進行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進細胞貼壁。 4. 消化液 進行傳代細胞培養(yǎng)時，為了使細胞脫離生長表面和細胞離散成單個細胞，通常使用消化液。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時間保持恒定的pH值范圍。 (三) 消毒技術(shù) 在細胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項工作，它直接影響實驗的結(jié)果。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學滅菌法，即利用化學消毒劑。一般要求15磅壓力下20min。 4. 濾過消毒 適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。因為培養(yǎng)條件的一致性，對于實驗結(jié)果的可信性有極為重要的影響。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細胞生長表面的斑點，搖動培養(yǎng)器皿可消失。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。對支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。 ③顯微鏡下，細胞顯藍色的為死亡細胞，尤其是核深染，而未染的細胞為存活細胞。 (2) 試劑： 溶液 ％NaCl，％％牛血清白蛋白。 (3) 操作步驟：離心，以適當速度使所有細胞沉淀而不引起細胞損傷。 取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的樣品(取決于培養(yǎng)細胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進行比色。用r計數(shù)器檢測無細胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細胞的存活情況。例如，形態(tài)學參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細胞特性鑒定的指標，其中形態(tài)學與生長特性的測定相對容易進行。成纖維樣細胞系指在單層細胞培養(yǎng)時，細胞的長度要大于其寬度的兩倍的細胞，而上皮樣細胞系指呈多角形的細胞。一般認為，在培養(yǎng)中的細胞，是處于不同的生長階段。接種效率是測定植入小量細胞(2~50個／cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水沖洗后，計算克隆數(shù)。 3. 其它檢查 除上述指標外，在細胞培養(yǎng)時，可進行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細胞的特性。一般性篩選系列化合物的一般毒性時，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細胞系。常用的細胞系有CHO、V7Hela、BHR及L929等。 解決這個問題有兩個方法，一是加S9，二是與原代肝細胞復(fù)合培養(yǎng)。在試驗中可設(shè)立適當?shù)挠袡C溶劑對照和培養(yǎng)液對照。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 5. 毒性指標的選擇 依據(jù)不同的試驗?zāi)康暮驮囼灄l件，可選擇不同的觀察指標。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用[14C]亮氨酸蛋白試驗和[3H]尿嘧啶參入RNA試驗等指標，以判斷受試物對培養(yǎng)細胞的大分子合成與降解的有無作用。故許多外源化學物引起機體的損害作用，有可能與亞細胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。對外源化學物毒作用機理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗、細胞試驗等，綜合作出評價。杵是由馬達傳動，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。 2. 離心機 是亞細胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機，最大轉(zhuǎn)速為18 000～24000rpm，和超速離心機，最大轉(zhuǎn)速為50000～75000rpm。蔗糖為經(jīng)典亞細胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測定的干擾。此緩沖液在4℃條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。 (四) 微粒體酶的誘導方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導劑之一。還可以將藥溶于飲水，1ng／ml，大約7天后，可達到誘導效果。d)，大鼠80mg／(kg 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨立的細胞器。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。沉淀即微粒體，懸浮于10mmol／L Hepes凝膠過濾法不適于做多個樣品。等電點沉淀法是利用pH改變，使微粒體沉淀出來，在較低離心條件下，10000g l0min，即可制得微粒體。對于結(jié)締組織較多的肺、皮膚等臟器和對于小腸微粒體的制備較為麻煩。應(yīng)注意所有操作應(yīng)在0~4℃下進行，對于組織應(yīng)盡量除去血紅蛋白，較好的方法是臟器的原位灌流。由于MFO作用的復(fù)雜性以及成分的多樣性，通常認為使用單一方法進行MFO的評價不夠全面和可靠，因此，在毒理學中是采用多種檢測分析方法，從不同角度進行MFO作用的評定。 (1) 儀器：雙光束可記錄的分光光度計。此法可快速測定樣品的總細胞色素P450含量，即各種細胞色素P450同工酶(或稱亞型)的總和。因此，通用細胞色素C作為人工電子受體，來測定這種微粒體黃素蛋白酶。 (二) 代謝法 代謝法可分為NADPH消耗量測定、氧耗測定和MFO催化代謝產(chǎn)物生成量測定。HC