【正文】 測定和色譜分析等。故可用甲醛的生成量表示MFO活力。本法簡便，易于掌握，是測定MFO的N和O脫烷基作用常用的方法之一，廣泛用于肝臟微粒體制備物MFO的活力評定。minl但可加入氨基脲(1 mmol／L)，增加對甲醛的捕捉能力，以提高其靈敏度，擴(kuò)大本法的應(yīng)用范圍。由于14C標(biāo)記底物不易取得，且14C廢棄的處理較為復(fù)雜和需特殊的設(shè)備及技術(shù)人員，故本法在一般實(shí)驗(yàn)室不易開展。例如，通過苯胺和環(huán)己巴比妥測定羥化作用；偶氮化合物和硝基化合物測定還原作用；對硝基茴香醚測定O脫烷化作用等。 (2) 熒光分光光度法：原理是利用MFO催化反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度，測定MFO的活力。mg蛋白)，適用于肝外組織和培養(yǎng)細(xì)胞的MFO活力的評定。經(jīng)過O—脫烷基作用，生成具有高強(qiáng)度熒光的酚類產(chǎn)物7羥基香豆素和7羥基試鹵靈。測定7二氧基香豆素的激發(fā)(excitation)和發(fā)射(emission)波長分別為380nm和452nm，而7二氧基試鹵靈的分別為525nm和582nm。解決方法是加抽提步驟， 4mol／L HCl終止反應(yīng)后，用6ml氯仿抽提，測定4ml氯仿與4ml甘氨酸氫氧化鈉緩沖液中的7羥基香豆素。反應(yīng)結(jié)束后，—羥基苯并(a)芘和剩余底物，然后將氫氧化鈉加入抽提液中，使熒光產(chǎn)物形成水溶性中的酚鹽，易與底物分離，可測定產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。本法常用于甾體和芳香族化合物羥化反應(yīng)的測定。(4) 色譜分析法：利用層析技術(shù)分離MFO催化反應(yīng)中的各種產(chǎn)物，然后進(jìn)行定性或定量測定。例如，多環(huán)芳烴、甾體化合物和芐丙酮香豆素(warfarin)等代謝產(chǎn)物，可用氣相色譜或高效液相色譜分離，再用標(biāo)準(zhǔn)品或比色等方法對產(chǎn)物進(jìn)行測定，以產(chǎn)物生成量的多少評定MFO的活力。例如，利用高效液相色譜闡明苯并(a)芘的全部代謝過程和終致癌物。全部器械如勻漿器、燒杯、離心管等，以及緩沖液應(yīng)放4℃冰箱內(nèi)預(yù)冷。迅速取出肝臟(約10g重)，剪去結(jié)締組織和血管，放人燒杯內(nèi)，用預(yù)冷的緩沖液清洗2～3次，盡可能洗去血液。將肝臟轉(zhuǎn)入50ml燒杯內(nèi)，有剪刀剪成小的組織塊，再用預(yù)冷的緩沖液洗2～3次，轉(zhuǎn)入勻漿器內(nèi)。當(dāng)杵沒有額外阻力能進(jìn)入玻管底物(大約需6次上下)時(shí)，再做4次上下即完成勻漿步驟。進(jìn)行差速離心，按下列步驟進(jìn)行：肝勻槳 離心，460g 10 min上清液 沉淀(包括細(xì)胞核，紅細(xì)胞離心，12500g 10 min 及大的細(xì)胞碎片)沉淀 （含有線粒體） 上清液 棄去 經(jīng)12500g離心的沉淀，從外觀上可分為三個(gè)不同區(qū)帶：底層為白色或紅色，內(nèi)有殘留的細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞；中層為深棕色，是大量完整的線粒體和一些溶酶體；上層為絨毛狀，有光澤，帶粉紅色，為一些破的線粒體和微粒體。加2—3ml緩沖液重新懸浮，即為線粒體的制備物，其蛋白濃度約為30mg／ml。 (二) 亞線粒體顆粒的制備 其原理是利用超聲波作用，破壞線粒體外膜，再經(jīng)超速離心獲得僅有內(nèi)膜的亞線粒顆粒。 1. ／L蔗糖，含有1mmol／L EDTA，10mmol／L Tris 2. 操作步驟 ①用10000gl0min，離心沉淀線粒體。 ③經(jīng)超聲處理的線粒體制備物，用緩沖液稀釋2倍，以29 000gl5min，以沉降完整的線粒體和較大部分的線粒體。用等體積的緩沖液再洗一次。 ⑤注意事項(xiàng)：在超聲處理過程中，保持線粒體制備物溫度不要升高，維持在4℃以下。后者是主要因素，它僅能通過測定各種代謝的功能來評定。 (一) 線粒體呼吸功能的測定 線粒體的氧化磷酸化系統(tǒng)由兩個(gè)不同但又緊密聯(lián)系的多酶系統(tǒng)組成，即呼吸鏈和ATP酶／合成酶的兩個(gè)系統(tǒng)。 1. 試劑 (1) ／L蔗糖，5 mmol／LKH2PO4，10 mmol／L KCl，5 mmol／L FeCl2溶于10mmol／L Tris (2) 底物：所有三羧酸循環(huán)(TEA)的中間產(chǎn)物，如3—羥基丁酸、谷氨酸、脯氨酸和脂肪酸均可以。 2. 電極調(diào)試 (1) 打開電極、磁力攪拌器、紙記錄儀和恒溫水浴器的開關(guān)，使它們平衡至少30min。 (3) 取2ml呼吸緩沖液，在30℃預(yù)熱數(shù)分鐘，并完全用空氣飽和后，放人反應(yīng)室，開始攪拌并記錄，速度為1cm／min。此為“空氣線”，即是用空氣完全飽和的緩沖液。 (5) 關(guān)掉攪拌器，記錄筆瞬間向下偏移，再打開攪拌器，筆應(yīng)回到“空氣線”。 (6) 在確定電極反應(yīng)正常后，加入少量連二亞硫酸鈉固體，使記錄筆迅速下移。此時(shí)，緩沖液為無氧狀態(tài)，筆處的位置為“氮?dú)饩€”。 3. 線粒體呼吸的測定 (1 ) ，約含蛋白4mg，進(jìn)入電極室，注意排除空氣，調(diào)正電極位置。 (2) 在不改變緩沖液氧濃度的情況下，向電極室加人不同的試劑，其理想辦法是用微量注射器，并且每次加入量不超過20μl。 (3) 加入不同代謝物后，線粒體的代謝狀況見表125。實(shí)驗(yàn)中主要觀察狀態(tài)狀態(tài)4，以計(jì)算呼吸調(diào)控比(respiratory control ratio，RCR)。加底物S或P+M，激發(fā)呼吸，使線粒體進(jìn)入狀態(tài)4； 記錄23min后，加入已知量的ADP，激發(fā)線粒體呼吸進(jìn)入狀態(tài)3。計(jì)算RCR的狀態(tài)4應(yīng)是加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4，因?yàn)槠鹗嫉臓顟B(tài)4總是要比加ADP后出現(xiàn)的狀態(tài)4慢。通過記錄筆的移動(dòng)，縱軸為氧耗，橫軸為時(shí)間，可求出呼吸速率。min)，狀態(tài)4為23ng atom O／(mg蛋白min)，狀態(tài)4為l0ng atom O／(mg蛋白故琥珀酸的PCR為4，丙酮酸加蘋果酸約為RCR為5。 4. ADP／O比值測定 在生物化學(xué)上，P／O比指磷酸化與呼吸之間的化學(xué)計(jì)算關(guān)系，常用Warburg壓力計(jì)來測定。ADP的加入量是已知，加入后線粒體的氧耗量，可通過圖WX中的X求得。ADP／O比值取決于線粒體的制備情況，ADP加入量及O2濃度測定的精確性，它是判斷線粒體功能是否完好的指標(biāo)之一。外源化學(xué)物抑制線粒體的氧化磷酸化過程，將它們的抑制作用研究與已知抑制劑作用比較，可探討外源化學(xué)物作用線粒體氧化磷酸化的機(jī)理。表125 線粒體的代謝狀況 代謝物濃度狀態(tài) 呼吸速率 速率限制因素 O2 ADP 底物1 高 低 低 慢 ADP水平2 高 高 無 慢 底物水平3 高 高 高 快 呼 吸 鏈 4 高 低 高 慢 ADP水平 5 無 高 高 無 氧 水 平表126 線粒體抑制劑的分類 類 型 代表性抑制劑 呼吸鏈抑制 部位I 魚藤酮 部位Ⅱ 抗霉素A 部位Ⅲ 氟化鉀 解偶聯(lián)劑 CCCP或DNP ATP酶／合成酶抑制 寡霉素 底物轉(zhuǎn)運(yùn) 丁基丙二酸(二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)) 離子轉(zhuǎn)運(yùn) 鈣紅(Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn))表127 ATP合成測定的加樣方案 測定項(xiàng)目 緩沖液 糖激酶 線粒體制備物 H2O 底 物 空 白 1ml 20μl 50μl 30μl — 對 照 1ml 20μl 50μl 30μl 10μl 測 定 1ml 20μl 50μl 2. 經(jīng)典抑制作用 經(jīng)典抑制作用見圖126。加入底物琥珀酸(S)可刺激呼吸，是因?yàn)殓晁峥衫@過魚藤酮的抑制阻礙進(jìn)入呼吸鏈。加入四甲基—對苯胺二胺／抗壞血酸(TMPD／ascorb)，它們是人工的電子供體，故可將電子輸入抗霉素A，刺激線粒體呼吸，如加氰化鉀(CN)可阻斷由TMPD／ascorb刺激的呼吸。當(dāng)加入蒼術(shù)苷(AF4)，不影響狀態(tài)4。然而，加人一解偶聯(lián)劑，仍可像正常一樣，刺激線粒體呼吸，表明假如有抑制劑已經(jīng)作用于呼吸鏈，則解偶聯(lián)劑不可能刺激線粒體的呼吸。需用其它實(shí)驗(yàn)加以區(qū)別。因?yàn)樗且环NCa2+轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊抑制劑。本研究應(yīng)注意的是：①加人多種抑制劑，應(yīng)保證兩次實(shí)驗(yàn)之間，徹底清洗電極室；②對于不溶于水的受試物，應(yīng)設(shè)立溶劑對照，觀察溶劑是否對線粒體有作用。 (三) ATP合成的測定 測定線粒體氧化磷酸化除氧化電極外，還有另一種方法，即測定ATP合成量。本法簡便易行，又不需特殊的儀器。再者，ATP合成的測定，不同于偶聯(lián)的氧消耗，受線粒體制備的質(zhì)量影響較小。 HCl緩沖液，／L蔗糖，22mmol／L葡萄糖，5mmol／L磷酸二氫鉀，2mmol／L MgCl2，2mmol／L ADP等。HCI緩沖液，／20μl的溶液。7H20溶于250ml蒸餾水。 2. 方法 關(guān)鍵是反應(yīng)混合物要不斷充氣。用閃爍瓶或小的細(xì)頸瓶作反應(yīng)容具。 表128 AW合成測定的加樣方案 測定項(xiàng)目 緩沖液 糖激酶 線粒體制備物 H2O 底物 空 白 1ml 20μl 50μl 30μl — 對 照 1ml 20μl 50μl 30μl 10μl 測 定 1ml 20μl 50μl (2) 10min后終止反應(yīng)，取20μl進(jìn)一小塑料管，再加200μl 10％TCA，混勻，離心5min． (3) 取100μl上清液加人一試管中，再加3ml蒸餾水，充分混勻，混勻，10min后，在750nm處測定其光密度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～／LPi)，計(jì)算出Pi的含量。結(jié)果表示: nmolATP／(mg蛋白對于肝臟線粒體底物琥珀酸或丙酮酸加蘋果酸的正常值分別為300和100nmolATP／(mg蛋白 第四節(jié) 生物膜的制備與其性質(zhì)的研究方法 一、大鼠肝細(xì)胞膜的制備 其基本原理是將肝組織在含有Ca2+離子的低滲碳酸氫鈉緩沖液中溫和勻漿，使細(xì)胞膜保持較大的膜片；其次，應(yīng)用低速離心使細(xì)胞膜片與細(xì)胞核一起從勻漿中分離，再利用細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間的密度差異，用密度梯度離心將細(xì)胞膜從低速離心獲得的粗核部分中分離出來。(二) 儀器設(shè)備制備型超速離心機(jī)，Potter勻漿器(三) 操作步驟將大鼠禁食1224h后，斷頭處死，盡量放干凈血液，迅速取出肝臟，隨即用預(yù)冷的生理鹽水洗滌數(shù)次，盡量除去殘留的血液。然后，用緩沖液A將勻漿稀釋10倍，攪拌、靜置。 在差速離心分離所得的沉淀中，加入70％(W／W)的蔗糖溶液，轉(zhuǎn)移至超速離心管中。在超速離心100000g，120min。／L碳酸氫鈉緩沖液，洗滌，以除去蔗糖，即獲得肝細(xì)胞膜制備物。肝細(xì)胞膜的標(biāo)志酶有5’核苷酶、Na+、K+—ATPase等，測定方便，無需大型儀器。還有膜上的其它蛋白如膜抗原、激素受體及外源凝集素受體等可供利用鑒定膜的分離情況。但在使用時(shí)尚有一些問題，如共價(jià)標(biāo)記有時(shí)會(huì)改變膜的天然性質(zhì)，小分子標(biāo)記物可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或吞噬入細(xì)胞等。人紅細(xì)胞去除血紅蛋白后即得血影，即紅細(xì)胞膜。 (一) 紅細(xì)胞膜 常用的制備方法是在低滲條件下脹破紅細(xì)胞，離心20000g。此種膜最接近整體系統(tǒng)(in vivo)，但它不能控制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)境；在應(yīng)用上有一定的局限性。 (二) 再封血影 近年來發(fā)現(xiàn)在一定條件下，脹破了的紅細(xì)胞可以重新封閉，對K+等離子不通透，給研究紅細(xì)胞膜提供了一模式。 2. 將低滲脹破的紅細(xì)胞在0℃條件下，過BiogdA柱，柱上的1／，以利膜與血紅蛋白分離，下2／，有利于隨后紅細(xì)胞空泡的重新封閉，當(dāng)膜從柱上流出后即用3Mol／L KCl。在37℃溫育l h，即獲得重新封閉血