【正文】 凍結(jié)保護(hù)劑，冷凍干燥 ,即得。 3．超聲波分散法：水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液，加入磷脂與膽固醇及脂溶性藥物成共溶于有機(jī)溶劑的溶液，攪拌蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，殘留液經(jīng)超聲波處理 ,然后分離出脂質(zhì)體。 制備脂質(zhì)體的方法原則都可用于制備磁性脂質(zhì)體。 ④ 鹽析固化法（ Salting out coagulation method）：就是將藥物和包封材料如明膠溶于水中，在表面活性劑存在下，高速攪拌，徐徐加入鹽類沉淀劑（如硫酸鈉溶液）使鹽析，加少量溶劑化劑（ Resolving 232 agent）如乙醇、異丙醇等，至混濁剛消失，繼續(xù)攪拌并加入適量固化劑（如戊二醛水溶液）固化，經(jīng)過(guò)透析或經(jīng)葡聚糖凝膠柱除去鹽類而制成。 此外制備普通納米粒的方法也可以借鑒用以制備磁性納米粒，只是在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候加入磁性納米粒。反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后經(jīng)離心除去體系中的大粒子和聚集物，用 Sephacryl S300 凝膠柱進(jìn)行分離，棄去非磁 性部分，磁性組分即 Dextran MNPs，用去離子水透析后凍干封存。取棉籽油 100mL 并加熱至 100℃ ~150℃之間，加熱后置于 1500rpm 的加熱振蕩器上，維持溫度進(jìn)行振蕩，將超聲后的混懸液以（ 100177。具體操作步驟如下： 231 向 磁流體中加入 十二烷基硫酸鈉、 丙烯酰胺、 甲叉雙丙烯酰胺，攪勻通氮?dú)夂筮M(jìn)行照射，總輻射劑量達(dá) 8000Gy 后向反應(yīng)體系中補(bǔ)加 丙烯酰胺、 甲叉雙丙烯酰胺和 烯丙胺，繼續(xù)照射 8000Gy，用水反復(fù)洗滌。 ⑤ 系統(tǒng)應(yīng)具有足夠的載藥能力（ Loading capacity），具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和生物降解速度。 ② 磁性介質(zhì)粒子大小應(yīng)合適，一般在 10nm~20nm 之間，最大不能超過(guò) 100nm。有的磁性載藥系統(tǒng)已進(jìn)入臨床研究階段；有更多的磁性納米粒以及磁性載體系統(tǒng)正處于不同的試驗(yàn)研究階段。 磁性納米粒和磁性微球還可進(jìn)一步與抗體結(jié)合，制備成免疫磁性納米?；蛎庖叽判晕⑶?，它們?cè)谂R床和生物醫(yī)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很多應(yīng)用，主要是用于細(xì)胞的分離，如用于清除血液中的癌細(xì)胞等。 230 第 8 章 磁性納米載體 磁性納米粒（ Magic Nanomaterials）是指大小在納米尺度的磁性材料，如三氧化二鐵或四氧化三鐵的納米粒。 為了討論方便，本章將磁性納米粒制備的上述各種給藥系統(tǒng)統(tǒng)稱為磁性納米載藥系統(tǒng)?？梢栽O(shè)想，隨著納米科技的進(jìn)展和納米生物新材料的不斷出現(xiàn)，磁性納米粒將給生物醫(yī)藥帶來(lái)新的變革和快速的發(fā)展。使得外磁場(chǎng)對(duì)其能夠產(chǎn)生足夠的吸引力，從而將其靶向于治療部位及其周圍組織。在靶部位釋放藥物的速度適宜，保證在該部位能夠釋放出大部分藥物。控制實(shí)驗(yàn)條件，可得到直徑不同的磁性納米粒或磁性微球。 1）滴 /min 的速度滴入預(yù)熱振蕩的棉籽油中，振蕩加熱維持 10min，然后置于冰塊中冷卻至25℃ , 用 60mL 無(wú)水乙醚洗滌 4 次，磁性納米粒經(jīng)凍干，在 4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。還可以將所制得的 Dextran MNPs 進(jìn)行羧甲基化處理制備羧甲基葡聚糖磁性納米粒（ CDM MNPs）。這些方法包括 [6]： ① 膠束聚合法（ Micell polymerization method）：就是將聚合物水溶性單體及藥物溶解于水中，與表面活性劑存在下經(jīng)攪拌分散至大量疏水介質(zhì)中（如正己烷），然后加入引發(fā)劑或在 γ 射線、 X射線、紫外光或可見(jiàn)光照射下發(fā)生聚合而得。 磁性脂質(zhì)體的制備 磁性脂質(zhì)體的研究 開始于二十世紀(jì)八十年代中后期。 1．薄膜分散法：磷脂與膽固醇等類脂質(zhì)及脂溶性藥物溶于氯仿（或其它有機(jī)溶劑）中，將該氯仿液于玻璃瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) ,使在玻璃瓶的內(nèi)壁上形成一薄膜；將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃瓶后不斷攪拌，即得。本法制備的大多為單室脂質(zhì)體。 5．凍融法：先制備未包封藥物的小單室脂質(zhì)體，在凍干前將待包封的藥物加入，在快速冷凍過(guò)程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質(zhì)體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時(shí)存在，此狀態(tài)不穩(wěn)定，在緩慢融化過(guò)程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質(zhì)體。 7．復(fù)乳法：將少量水相與較多量的磷脂油相進(jìn)行乳化（第 1 次）形成 W/O 的反相膠團(tuán)，減壓除去部分溶劑，然后加較大量的水相進(jìn)行乳化（第 2 次），形成 W/O/W 型復(fù)乳，減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得脂質(zhì)體。此法適合于制備脂溶性蛋白類藥物的脂質(zhì)體。 此外，還有前體脂質(zhì)體法、鈣融合法、加壓擠 出法、 pH 梯度法、噴霧干燥法等。但是上述方法對(duì)于 Fe3O4 的包載量?jī)H為 133μ g/mL。 上述方法得到磁性脂質(zhì)體又可以選擇不同的脂質(zhì)材料制備成為磁性溫敏脂質(zhì)體。這些骨架材料應(yīng)該性質(zhì)穩(wěn)定、強(qiáng)度較 高、無(wú)毒副作用。 ② 將磁性納米粒分散在高分子骨架材料的水溶液中，加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣?，在一種疏水性溶劑中乳化成為 W/O 型乳劑，用熱固化法或交聯(lián)固化法使高分子骨架材料固化成磁性微 球 [11]。 ④ 將磁鐵礦本身作為（亞鐵一過(guò)硫酸）氧化一還原系統(tǒng)的一部分，聚合物可以完全包裹在磁鐵礦周圍。 免疫磁性微球的制備 免疫磁性微球（ Immunomagic microspheres， IMMS），或稱免疫磁珠（ Immunomagic Beads， IMB），是表面結(jié)合有單克隆抗體的磁性微球。吸附結(jié)合只有在微球具有非常大的表面積時(shí)才有可能比較牢固。 磁性納米載藥系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià) 對(duì)于得到的磁性納米載體 系統(tǒng) 要從如下一些方面考察其理化性能： 顆粒形態(tài)和粒徑檢測(cè) 采用掃描電鏡對(duì)樣品進(jìn)行表面形態(tài)的觀察（包括形狀、圓整度等）；將樣 品適當(dāng)稀釋，經(jīng)除塵或染色處理后，采用激光散射粒徑分析儀、圖像分析儀或光子相關(guān)光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得樣品的平均粒徑和粒徑分布，后者可以用粒徑分布概率圖的形式給出。 鐵含量的測(cè)定 測(cè)定鐵含量的一般方法包括磺基水楊酸法、鄰二氮菲（菲啶）法和原子吸收分光光度法等。 磺基水楊酸法的主要操作過(guò)程如下：取上述用樣品適量，加入 10%的 NH4Cl 溶液 ， 10%的磺基水楊酸溶液 ，滴加氨水至溶液變成黃色，再加補(bǔ)加氨水 ，用蒸餾水定容后，以空白溶液為參比，于 445nm 處測(cè)定吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐵的含量。 磁化強(qiáng)度是評(píng)價(jià)磁性納米粒磁響應(yīng)性的重要指針。 磁導(dǎo)向定位 1．體外磁導(dǎo)向定位 最簡(jiǎn)單的方法是將磁性納米粒的水分散溶液置于試管中，在其一側(cè)加上一定大小和形狀的磁鐵，記錄磁性納米粒全部集中于試管一側(cè)所需時(shí)間，時(shí)間越短磁定位性能越好。將每個(gè)吸附的制劑量除以吸附制劑量和未吸附制劑的量的綜合，計(jì)算導(dǎo)向制劑的定位百分率?？赏ㄟ^(guò)磁共振技術(shù)、藥物動(dòng)力學(xué)與組織檢查等方式進(jìn)行分析測(cè)定。如以 Cu 為靶源，在 40kV和 35mA 下測(cè)定磁性納米粒的 X 射線衍射圖，然后與 ?三氧化二鐵和四氧化三鐵的標(biāo)準(zhǔn)圖 譜進(jìn)行比對(duì)，判斷磁性納米粒的特征峰是否與 ?三氧化二鐵和四氧化三鐵的特征峰一致，從而確定其結(jié)構(gòu)類型。 載藥量的測(cè)定 對(duì)于載藥的磁性納米粒，可通過(guò)一定的處理將藥物與載體分離，或采用同位素標(biāo)記，而后通過(guò)高效液相、 分光光度法或液質(zhì)聯(lián)用等分析手段進(jìn)行測(cè)定。 1．化學(xué)穩(wěn)定性 這種穩(wěn)定性一方面包括脂質(zhì)體中孢粉藥物的穩(wěn)定性；另一方面包括脂質(zhì)體的膜材成分磷脂等容易發(fā)生水解和氧化，由于膜材的水解會(huì)使脂質(zhì)體制劑中的酸度升高；磷脂結(jié)構(gòu)中包含不飽和基團(tuán)可以自發(fā)地發(fā)生氧化反應(yīng)，這種氧化反應(yīng)機(jī)制是游離基連鎖反應(yīng)，產(chǎn)生的氧化反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)人體有一定毒性，因此脂質(zhì)體的化學(xué)穩(wěn) 定性著重研究防止和控制脂質(zhì)體氧化的問(wèn)題，以及檢查和評(píng)價(jià)有氧化反應(yīng)產(chǎn)生的有毒的過(guò)氧化物的方法。測(cè)定方法是將脂質(zhì)體樣品加入人血漿，于透析管中 370C 孵育，測(cè)定不同時(shí)間從脂質(zhì)體中釋出藥物的量，并同時(shí)在顯微鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)的變化。這種構(gòu)想的實(shí)現(xiàn)將降低藥物使用劑量（ Dose of administration）和毒副作用（ Side effects）、提高藥物的治療效率、拓展某些藥物的使用范圍、減輕病人的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，可以說(shuō)這是治療物質(zhì)使用的又一次革命。已經(jīng)證明，在血流速率為 ~，在 的外磁場(chǎng)下，就足以使含有 20%（ g/g）磁性載體全部滯留。 磁性納米粒廣泛用作藥物的載體，尤其作為抗癌藥物載體的研究較多。納米粒中藥物在腫瘤組織的 緩慢釋放，能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持高濃度化療藥物水平 [17]。有人 [18]用 10nm~50nm 的氧化鐵磁性納米粒制備了含 3H 放線菌素 D 的聚氰基丙烯酸烷基酯 NP，其粒徑為 220nm。 磁性納米粒的水分散體在醫(yī)藥方面也有較多的研究報(bào)導(dǎo)。作者認(rèn)為，這種磁性介導(dǎo)的靶向藥物輸送系統(tǒng)為惡性腫瘤的治療提供了獨(dú)特的方法和手 段，這種治療方式通常不會(huì)產(chǎn)生全身系統(tǒng)的毒性，這種技術(shù)很有可能被用于載帶放射性核素、抗腫瘤抗生素、細(xì)胞因子，甚至用于載帶基因。在此基礎(chǔ)上， Lubbe 等人 [22]在 14 位晚期實(shí)體瘤病人身上進(jìn)行了 載表阿霉素磁性納米粒的一期臨床試驗(yàn)。通過(guò)磁共振技術(shù)、藥物動(dòng)力學(xué)與組織檢查，表明一半的病人身上磁性納米粒成功地靶向輸送到了腫瘤部位，而且在治療中器官毒性沒(méi)有增加，只有當(dāng)藥物劑量超過(guò) 50mg/m2 時(shí)，有表阿霉素相關(guān)的毒性出現(xiàn)。一般采用的熱介質(zhì)就是氧化鐵的磁性納米粒。 磁性納米粒在臨床磁共振成像中的應(yīng)用 氧化鐵納米粒本身可以沒(méi)有磁性，當(dāng)在外加磁場(chǎng)存在時(shí)，氧化鐵納米粒就可很快產(chǎn)生磁性，而且一旦外加磁場(chǎng)撤消，其磁性又可消失，氧化鐵納米粒的這種性能被稱為超順磁性。但隨著臨床使用的增加， GdDTPA 的一些明顯的不足這處被人們所認(rèn)識(shí)，如：它在體內(nèi)消除太快（入血后可迅速通過(guò)細(xì)胞間隙，并經(jīng)腎臟排泄）；而且體內(nèi)分布沒(méi)有特異性，使MR 圖像對(duì)比不能明顯改善，同時(shí)也需要相應(yīng)的設(shè)備能夠快速掃描，其價(jià)格也較貴。 SPIO 的基本結(jié)構(gòu)是以氧化鐵顆粒為核芯，外包裹葡聚糖等，以使其更好地分散，直徑一般在 nm 數(shù)量級(jí)。一類是普通的超順磁性氧化鐵納米粒（ SPIO）：一般直徑 40nm~400nm 之間不等。 AMI25 在美國(guó)、歐洲及日本等國(guó)已完成臨床試 驗(yàn)，已有商品出售，國(guó)內(nèi)現(xiàn)也有部分地區(qū)在臨床上使用。 2．超順磁性氧化鐵納米粒的生物學(xué)特性 超順磁性氧化鐵 納米粒 在體內(nèi)的分布具有明顯的特異性。 超順磁性氧化鐵的粒徑大小對(duì)其進(jìn)入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的部位有較大影響，一般直徑較大的 SPIOs 主要為肝、脾的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所攝入。這是由于 USPIOs 粒 徑 較小而且表面包有較厚的葡聚糖層，與血漿蛋白和調(diào)理素的作用減弱，影響了吞噬細(xì)胞對(duì)其的攝入，血循環(huán)半衰期長(zhǎng)達(dá) 100min 以上，而在血管中停留較 長(zhǎng)時(shí)間使得其可以通過(guò) 毛細(xì)胞血管壁，更廣泛地分布于組織中，特別是可通過(guò)毛細(xì)血管末梢進(jìn)入骨髓，并可通過(guò)淋巴管，輸送到淋巴結(jié)。 從目前臨床應(yīng)用來(lái)看，超順磁性氧化鐵的臨床應(yīng)用劑量都遠(yuǎn)小于其最低中毒劑量。 AMI25 的臨床劑量稍大些 [27]，但 70kg 體重的成年人也只需接受約 80mg 的 Fe 就可滿足診斷需要。 總體上講， SPIOs 和 USPIOs 是兩類安全性較高的 MR 對(duì) 比劑。超順磁性氧化鐵納米粒分布于組織后，呈不均勻分布，造成局部磁場(chǎng)的不均勻，從而加速了質(zhì)子去相位的過(guò)程，縮短了組織的 T2 和 /或 T1 值，使組織信號(hào)降低（陰性增強(qiáng)）或增高（陽(yáng)性 增強(qiáng)）。 有人 [27]在 場(chǎng)強(qiáng)下，對(duì) 15 例肝轉(zhuǎn)移瘤用 AMI25 進(jìn)行增強(qiáng)掃描，結(jié)果與增強(qiáng)前的 MR 圖像相比，檢出病灶的數(shù)量增加了 16 倍，檢出病灶的最小直徑也從增強(qiáng)前的 下降到 ，效果非常明顯。良性肝臟腫瘤的信號(hào)雖然降低，但弱于正常肝組織，而且具有一定的特征性，故良性肝臟腫瘤的檢出率仍可達(dá) 90%以上。有人用 SHU 555A 在 48 位病人身上進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明，靜注 SHU 555A 明顯改善了門脈系統(tǒng)的顯示，三級(jí)分支的顯示率從增強(qiáng)前的 %上升到增強(qiáng)后的 %。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的血管在靜注 AMI227 后45min 都增強(qiáng)效果都非常明顯，并且以三種劑量下的增強(qiáng)程度沒(méi)有明顯差別。在動(dòng)物模型上把 FeOBPA應(yīng)用于腹部血管的 MRA，結(jié)果證明在普通場(chǎng)強(qiáng)下 FeOBPA 就可進(jìn)行 MRA。 超順磁性氧化鐵納米粒除了應(yīng)用于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)外，也有用作腦血流灌注和心肌缺血評(píng)價(jià)的報(bào)導(dǎo)。用脂質(zhì)體包裹的超順磁性氧化鐵納米粒，可應(yīng)用于鑒別淋巴結(jié)反應(yīng)性增生和腫瘤轉(zhuǎn)移， 同時(shí)脂質(zhì)膜上結(jié)合特定的功能團(tuán)可使脂質(zhì)體包裹的造影劑成為靶向造影劑，如含乳糖基?；拾贝嫉闹|(zhì)體可用于肝細(xì)胞靶向給藥，含聚乙烯二醇醚的脂質(zhì)體可靶向于梗塞心肌等。下面以免疫磁性微球?yàn)榇碚f(shuō)明磁性納米粒在生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用。 IMM 與細(xì)胞的結(jié)合可以采取兩種方法，直接法和間接法。直接法可以減少洗 滌和培養(yǎng)步驟，但對(duì) IgM單抗很少能適用。一般有三類不同的方法， 243 即流式細(xì)胞儀技術(shù)（ FACS）、表面聯(lián)上二抗的異體紅細(xì)胞花環(huán)技術(shù)、將抗體被動(dòng)吸附在聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上的 Panning 技術(shù)。 2．免疫磁性微球在分子生物學(xué)上的應(yīng)用 應(yīng)用于分子生物學(xué)上的磁性微球表面不是連接抗體，而是連接親和素，通過(guò)親和素一生物素反應(yīng)與靶核酸相連。為將生物素插入 DNA 鏈中，可以來(lái)用生物素化的引物或用 Klenow 聚合酶和生物素化的核苷酸進(jìn)行末端標(biāo)記。 (2) 純化 PolyA+mRNA 將 PolyT 直接共價(jià)連接于或通過(guò)親和素一生物素連接于磁性微球上即可用于分離