【正文】 凍結保護劑，冷凍干燥 ,即得。 3．超聲波分散法：水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液，加入磷脂與膽固醇及脂溶性藥物成共溶于有機溶劑的溶液，攪拌蒸發(fā)除去有機溶劑，殘留液經超聲波處理 ,然后分離出脂質體。 制備脂質體的方法原則都可用于制備磁性脂質體。 ④ 鹽析固化法（ Salting out coagulation method）：就是將藥物和包封材料如明膠溶于水中，在表面活性劑存在下，高速攪拌，徐徐加入鹽類沉淀劑（如硫酸鈉溶液）使鹽析，加少量溶劑化劑（ Resolving 232 agent）如乙醇、異丙醇等，至混濁剛消失，繼續(xù)攪拌并加入適量固化劑（如戊二醛水溶液）固化，經過透析或經葡聚糖凝膠柱除去鹽類而制成。 此外制備普通納米粒的方法也可以借鑒用以制備磁性納米粒，只是在適當?shù)臅r候加入磁性納米粒。反應產物冷卻后經離心除去體系中的大粒子和聚集物，用 Sephacryl S300 凝膠柱進行分離，棄去非磁 性部分，磁性組分即 Dextran MNPs，用去離子水透析后凍干封存。取棉籽油 100mL 并加熱至 100℃ ~150℃之間，加熱后置于 1500rpm 的加熱振蕩器上，維持溫度進行振蕩，將超聲后的混懸液以（ 100177。具體操作步驟如下： 231 向 磁流體中加入 十二烷基硫酸鈉、 丙烯酰胺、 甲叉雙丙烯酰胺，攪勻通氮氣后進行照射，總輻射劑量達 8000Gy 后向反應體系中補加 丙烯酰胺、 甲叉雙丙烯酰胺和 烯丙胺，繼續(xù)照射 8000Gy，用水反復洗滌。 ⑤ 系統(tǒng)應具有足夠的載藥能力（ Loading capacity），具有一定的機械強度和生物降解速度。 ② 磁性介質粒子大小應合適，一般在 10nm~20nm 之間，最大不能超過 100nm。有的磁性載藥系統(tǒng)已進入臨床研究階段；有更多的磁性納米粒以及磁性載體系統(tǒng)正處于不同的試驗研究階段。 磁性納米粒和磁性微球還可進一步與抗體結合，制備成免疫磁性納米?；蛎庖叽判晕⑶?，它們在臨床和生物醫(yī)藥學實驗中有很多應用，主要是用于細胞的分離，如用于清除血液中的癌細胞等。 230 第 8 章 磁性納米載體 磁性納米粒（ Magic Nanomaterials）是指大小在納米尺度的磁性材料，如三氧化二鐵或四氧化三鐵的納米粒。 為了討論方便，本章將磁性納米粒制備的上述各種給藥系統(tǒng)統(tǒng)稱為磁性納米載藥系統(tǒng)。可以設想，隨著納米科技的進展和納米生物新材料的不斷出現(xiàn)，磁性納米粒將給生物醫(yī)藥帶來新的變革和快速的發(fā)展。使得外磁場對其能夠產生足夠的吸引力，從而將其靶向于治療部位及其周圍組織。在靶部位釋放藥物的速度適宜，保證在該部位能夠釋放出大部分藥物。控制實驗條件，可得到直徑不同的磁性納米?；虼判晕⑶颉?1）滴 /min 的速度滴入預熱振蕩的棉籽油中，振蕩加熱維持 10min，然后置于冰塊中冷卻至25℃ , 用 60mL 無水乙醚洗滌 4 次，磁性納米粒經凍干，在 4℃儲存?zhèn)溆?。還可以將所制得的 Dextran MNPs 進行羧甲基化處理制備羧甲基葡聚糖磁性納米粒（ CDM MNPs）。這些方法包括 [6]： ① 膠束聚合法（ Micell polymerization method）：就是將聚合物水溶性單體及藥物溶解于水中，與表面活性劑存在下經攪拌分散至大量疏水介質中（如正己烷），然后加入引發(fā)劑或在 γ 射線、 X射線、紫外光或可見光照射下發(fā)生聚合而得。 磁性脂質體的制備 磁性脂質體的研究 開始于二十世紀八十年代中后期。 1．薄膜分散法：磷脂與膽固醇等類脂質及脂溶性藥物溶于氯仿（或其它有機溶劑）中，將該氯仿液于玻璃瓶中旋轉蒸發(fā) ,使在玻璃瓶的內壁上形成一薄膜；將水溶性藥物溶于磷酸鹽緩沖液中，加入玻璃瓶后不斷攪拌，即得。本法制備的大多為單室脂質體。 5．凍融法：先制備未包封藥物的小單室脂質體，在凍干前將待包封的藥物加入，在快速冷凍過程中，由于冰晶的形成，使形成的脂質體膜破裂，形成冰晶的片層與破碎的膜同時存在，此狀態(tài)不穩(wěn)定，在緩慢融化過程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂質體。 7．復乳法：將少量水相與較多量的磷脂油相進行乳化（第 1 次）形成 W/O 的反相膠團，減壓除去部分溶劑，然后加較大量的水相進行乳化（第 2 次），形成 W/O/W 型復乳，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，即得脂質體。此法適合于制備脂溶性蛋白類藥物的脂質體。 此外，還有前體脂質體法、鈣融合法、加壓擠 出法、 pH 梯度法、噴霧干燥法等。但是上述方法對于 Fe3O4 的包載量僅為 133μ g/mL。 上述方法得到磁性脂質體又可以選擇不同的脂質材料制備成為磁性溫敏脂質體。這些骨架材料應該性質穩(wěn)定、強度較 高、無毒副作用。 ② 將磁性納米粒分散在高分子骨架材料的水溶液中，加入適當?shù)谋砻婊钚詣?，在一種疏水性溶劑中乳化成為 W/O 型乳劑，用熱固化法或交聯(lián)固化法使高分子骨架材料固化成磁性微 球 [11]。 ④ 將磁鐵礦本身作為（亞鐵一過硫酸）氧化一還原系統(tǒng)的一部分，聚合物可以完全包裹在磁鐵礦周圍。 免疫磁性微球的制備 免疫磁性微球（ Immunomagic microspheres， IMMS），或稱免疫磁珠（ Immunomagic Beads， IMB），是表面結合有單克隆抗體的磁性微球。吸附結合只有在微球具有非常大的表面積時才有可能比較牢固。 磁性納米載藥系統(tǒng)的質量評價 對于得到的磁性納米載體 系統(tǒng) 要從如下一些方面考察其理化性能： 顆粒形態(tài)和粒徑檢測 采用掃描電鏡對樣品進行表面形態(tài)的觀察（包括形狀、圓整度等）；將樣 品適當稀釋，經除塵或染色處理后，采用激光散射粒徑分析儀、圖像分析儀或光子相關光譜儀進行檢測，測得樣品的平均粒徑和粒徑分布，后者可以用粒徑分布概率圖的形式給出。 鐵含量的測定 測定鐵含量的一般方法包括磺基水楊酸法、鄰二氮菲（菲啶）法和原子吸收分光光度法等。 磺基水楊酸法的主要操作過程如下：取上述用樣品適量，加入 10%的 NH4Cl 溶液 ， 10%的磺基水楊酸溶液 ，滴加氨水至溶液變成黃色，再加補加氨水 ，用蒸餾水定容后，以空白溶液為參比，于 445nm 處測定吸收度，根據(jù)標準曲線計算鐵的含量。 磁化強度是評價磁性納米粒磁響應性的重要指針。 磁導向定位 1．體外磁導向定位 最簡單的方法是將磁性納米粒的水分散溶液置于試管中，在其一側加上一定大小和形狀的磁鐵，記錄磁性納米粒全部集中于試管一側所需時間，時間越短磁定位性能越好。將每個吸附的制劑量除以吸附制劑量和未吸附制劑的量的綜合，計算導向制劑的定位百分率?？赏ㄟ^磁共振技術、藥物動力學與組織檢查等方式進行分析測定。如以 Cu 為靶源，在 40kV和 35mA 下測定磁性納米粒的 X 射線衍射圖，然后與 ?三氧化二鐵和四氧化三鐵的標準圖 譜進行比對，判斷磁性納米粒的特征峰是否與 ?三氧化二鐵和四氧化三鐵的特征峰一致，從而確定其結構類型。 載藥量的測定 對于載藥的磁性納米粒，可通過一定的處理將藥物與載體分離，或采用同位素標記，而后通過高效液相、 分光光度法或液質聯(lián)用等分析手段進行測定。 1．化學穩(wěn)定性 這種穩(wěn)定性一方面包括脂質體中孢粉藥物的穩(wěn)定性；另一方面包括脂質體的膜材成分磷脂等容易發(fā)生水解和氧化，由于膜材的水解會使脂質體制劑中的酸度升高；磷脂結構中包含不飽和基團可以自發(fā)地發(fā)生氧化反應，這種氧化反應機制是游離基連鎖反應，產生的氧化反應產物對人體有一定毒性，因此脂質體的化學穩(wěn) 定性著重研究防止和控制脂質體氧化的問題，以及檢查和評價有氧化反應產生的有毒的過氧化物的方法。測定方法是將脂質體樣品加入人血漿，于透析管中 370C 孵育，測定不同時間從脂質體中釋出藥物的量，并同時在顯微鏡下觀察脂質體形態(tài)的變化。這種構想的實現(xiàn)將降低藥物使用劑量（ Dose of administration）和毒副作用（ Side effects）、提高藥物的治療效率、拓展某些藥物的使用范圍、減輕病人的經濟負擔，可以說這是治療物質使用的又一次革命。已經證明，在血流速率為 ~，在 的外磁場下，就足以使含有 20%（ g/g）磁性載體全部滯留。 磁性納米粒廣泛用作藥物的載體，尤其作為抗癌藥物載體的研究較多。納米粒中藥物在腫瘤組織的 緩慢釋放，能夠較長時間維持高濃度化療藥物水平 [17]。有人 [18]用 10nm~50nm 的氧化鐵磁性納米粒制備了含 3H 放線菌素 D 的聚氰基丙烯酸烷基酯 NP，其粒徑為 220nm。 磁性納米粒的水分散體在醫(yī)藥方面也有較多的研究報導。作者認為，這種磁性介導的靶向藥物輸送系統(tǒng)為惡性腫瘤的治療提供了獨特的方法和手 段，這種治療方式通常不會產生全身系統(tǒng)的毒性，這種技術很有可能被用于載帶放射性核素、抗腫瘤抗生素、細胞因子，甚至用于載帶基因。在此基礎上， Lubbe 等人 [22]在 14 位晚期實體瘤病人身上進行了 載表阿霉素磁性納米粒的一期臨床試驗。通過磁共振技術、藥物動力學與組織檢查，表明一半的病人身上磁性納米粒成功地靶向輸送到了腫瘤部位，而且在治療中器官毒性沒有增加，只有當藥物劑量超過 50mg/m2 時，有表阿霉素相關的毒性出現(xiàn)。一般采用的熱介質就是氧化鐵的磁性納米粒。 磁性納米粒在臨床磁共振成像中的應用 氧化鐵納米粒本身可以沒有磁性，當在外加磁場存在時，氧化鐵納米粒就可很快產生磁性，而且一旦外加磁場撤消，其磁性又可消失，氧化鐵納米粒的這種性能被稱為超順磁性。但隨著臨床使用的增加， GdDTPA 的一些明顯的不足這處被人們所認識，如：它在體內消除太快（入血后可迅速通過細胞間隙，并經腎臟排泄）；而且體內分布沒有特異性，使MR 圖像對比不能明顯改善，同時也需要相應的設備能夠快速掃描，其價格也較貴。 SPIO 的基本結構是以氧化鐵顆粒為核芯，外包裹葡聚糖等，以使其更好地分散，直徑一般在 nm 數(shù)量級。一類是普通的超順磁性氧化鐵納米粒（ SPIO）：一般直徑 40nm~400nm 之間不等。 AMI25 在美國、歐洲及日本等國已完成臨床試 驗，已有商品出售，國內現(xiàn)也有部分地區(qū)在臨床上使用。 2．超順磁性氧化鐵納米粒的生物學特性 超順磁性氧化鐵 納米粒 在體內的分布具有明顯的特異性。 超順磁性氧化鐵的粒徑大小對其進入網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的部位有較大影響，一般直徑較大的 SPIOs 主要為肝、脾的網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)所攝入。這是由于 USPIOs 粒 徑 較小而且表面包有較厚的葡聚糖層，與血漿蛋白和調理素的作用減弱，影響了吞噬細胞對其的攝入，血循環(huán)半衰期長達 100min 以上，而在血管中停留較 長時間使得其可以通過 毛細胞血管壁，更廣泛地分布于組織中，特別是可通過毛細血管末梢進入骨髓，并可通過淋巴管，輸送到淋巴結。 從目前臨床應用來看，超順磁性氧化鐵的臨床應用劑量都遠小于其最低中毒劑量。 AMI25 的臨床劑量稍大些 [27]，但 70kg 體重的成年人也只需接受約 80mg 的 Fe 就可滿足診斷需要。 總體上講， SPIOs 和 USPIOs 是兩類安全性較高的 MR 對 比劑。超順磁性氧化鐵納米粒分布于組織后，呈不均勻分布，造成局部磁場的不均勻，從而加速了質子去相位的過程，縮短了組織的 T2 和 /或 T1 值，使組織信號降低（陰性增強）或增高（陽性 增強）。 有人 [27]在 場強下，對 15 例肝轉移瘤用 AMI25 進行增強掃描，結果與增強前的 MR 圖像相比，檢出病灶的數(shù)量增加了 16 倍，檢出病灶的最小直徑也從增強前的 下降到 ，效果非常明顯。良性肝臟腫瘤的信號雖然降低，但弱于正常肝組織，而且具有一定的特征性，故良性肝臟腫瘤的檢出率仍可達 90%以上。有人用 SHU 555A 在 48 位病人身上進行了臨床試驗，結果表明，靜注 SHU 555A 明顯改善了門脈系統(tǒng)的顯示，三級分支的顯示率從增強前的 %上升到增強后的 %。結果發(fā)現(xiàn)所有的血管在靜注 AMI227 后45min 都增強效果都非常明顯，并且以三種劑量下的增強程度沒有明顯差別。在動物模型上把 FeOBPA應用于腹部血管的 MRA，結果證明在普通場強下 FeOBPA 就可進行 MRA。 超順磁性氧化鐵納米粒除了應用于網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)外，也有用作腦血流灌注和心肌缺血評價的報導。用脂質體包裹的超順磁性氧化鐵納米粒，可應用于鑒別淋巴結反應性增生和腫瘤轉移， 同時脂質膜上結合特定的功能團可使脂質體包裹的造影劑成為靶向造影劑，如含乳糖基?；拾贝嫉闹|體可用于肝細胞靶向給藥，含聚乙烯二醇醚的脂質體可靶向于梗塞心肌等。下面以免疫磁性微球為代表說明磁性納米粒在生物醫(yī)藥方面的應用。 IMM 與細胞的結合可以采取兩種方法，直接法和間接法。直接法可以減少洗 滌和培養(yǎng)步驟，但對 IgM單抗很少能適用。一般有三類不同的方法， 243 即流式細胞儀技術（ FACS）、表面聯(lián)上二抗的異體紅細胞花環(huán)技術、將抗體被動吸附在聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上的 Panning 技術。 2．免疫磁性微球在分子生物學上的應用 應用于分子生物學上的磁性微球表面不是連接抗體，而是連接親和素，通過親和素一生物素反應與靶核酸相連。為將生物素插入 DNA 鏈中，可以來用生物素化的引物或用 Klenow 聚合酶和生物素化的核苷酸進行末端標記。 (2) 純化 PolyA+mRNA 將 PolyT 直接共價連接于或通過親和素一生物素連接于磁性微球上即可用于分離