原核基因表達及其調(diào)控-wenkub
2023-05-23 13:26:26 本頁面
【正文】 白失活而對轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生阻遏作用。 (2) 由于使宿主細胞處于生長的逆境，容易發(fā)生載體 質(zhì)粒的丟失； (3) 非調(diào)控性地表達外源蛋白，容易受到蛋白酶的水 解作用，從而使最終的蛋白量并不高； (4) 形成不溶性的包含體蛋白。 啟動子： DNA分子中與 RNA pol I發(fā)生特定結(jié)合的序列，啟動轉(zhuǎn)錄過程。 核心酶（ ?2ββ’）： 轉(zhuǎn)錄功能單位 全酶（ ?2 ??’?） （ core enzyme） （ holoenzyme） σ因子 ：參與識別特異的啟動子 原核生物 RNA聚合酶能被 利福平（ rifampicin）所抑制 。 9) 轉(zhuǎn)錄起始位點 (Startsite)。 7) 上游（ Upstream） 。第二章 原核微生物的基因表達與操作 原核微生物的基因表達及其調(diào)控 原核微生物的基因表達產(chǎn)物的分離純化 （ 1）轉(zhuǎn)錄因素； （ 2）翻譯因素； （ 3）蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性； （ 4）胞外分泌的特性 一、原核生物的基因表達 第一節(jié) 原核生物的基因表達與調(diào)控因素 （一）、轉(zhuǎn)錄對基因表達的影響 要注意的關(guān)鍵名詞術(shù)語 : 1) 編碼鏈（有義鏈， the coding strand） 。 3) RNA聚合酶（ RNA polymerase） 。 5) 終止子（ A terminator） 。 利福平與 β 亞基相結(jié)合，從而抑制酶的活性。 啟動子有 強 /弱之分。 （一）可調(diào)控啟動子 (Regulatable Promoters)： 大腸桿菌中已開發(fā) 5種可調(diào)控啟動子 (1) Plac 啟動子：即 E. coli lac啟動子 。 lac 啟動子 ： （ 1） lac啟動子來源于大腸桿菌的乳糖操縱子，包括啟動子、活化蛋白（ catabolite activator protein, CAP）結(jié)合位點、操縱基因和 lacZ組成。 乳糖操縱子基因產(chǎn)物 : 1) lacI: 阻遏蛋白 。這樣，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時，高濃度的 cAMP水平能夠?qū)е氯樘遣倏v子的啟動子發(fā)生高水平的轉(zhuǎn)錄作用。 （ 1）由 trpR產(chǎn)生的阻遏蛋白只有在與色氨酸結(jié)合后才能形成有活性的阻遏蛋白，它可以與操縱基因結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄的起始。包括： （ 1） PtacI： PlacUV5的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū)； （ 2） PtacII： Ptrp的 35區(qū)（一段合成的包括 Pribnow框在 內(nèi)的 46bp的 DNA） ＋ Plac的操縱基因； （ 3） Ptac12： Plac的 10區(qū) ＋ Ptrp的 35區(qū) 所有 Ptac都受 IPTG的誘導(dǎo)，同時受到阻遏蛋白的阻遏調(diào)控。 mRNA與核糖體的結(jié)合能力： （ 1） RBS與翻譯起始密碼子（ AUG）之間的距離要合適； （ 2）編碼從結(jié)合位點到起始幾個密碼子之間的的 DNA序 列不應(yīng)含有可能形成 環(huán)狀結(jié)構(gòu) 的序列，否則會妨礙 與核糖體的結(jié)合。 當(dāng)外源基因插入后，如果能夠保持正確的 ORF，就可以形成由外源基因編碼的多肽和 ?半乳糖苷酶組成的融合蛋白。 如： pDR720 質(zhì)粒 pDR720是一個含 trp啟動子的表達載體，它來源于 p51， trp啟動子在 Sma I位點插入，在啟動子的下游有 3個位點， Sal I、 BamH I和 Sma I，可以插入外源基因。 pBADHisA, B, C。 （ 1）來源于 pBR322, pBR322的 EcoRI/BamHI位點 被 PL 和 N基因取代； （ 2）外源基因可以插入到 N基因中的 HpaI位點； （ 3）當(dāng)培養(yǎng)溫度為 2931?C時， PL啟動子處于阻遏 狀態(tài)；但當(dāng)溫度升到 42?C，發(fā)生脫阻遏。 溫度對 3種表達載體質(zhì)?？截悢?shù)的影響 （四）大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng) 小規(guī)模培養(yǎng)（ 1～ 5L）含表達載體的重組菌株時，其調(diào)控可以直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，或者升高溫度，但是在半工業(yè)化（ 20～200L）或者工業(yè)化大規(guī)模（大于 200L）生產(chǎn)時，不能采用小規(guī)模的方法： （ 1）直接向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物如 IPTG，由于需要量較大，成本 高，不經(jīng)濟； （ 2）即使是使用溫度敏感的表達載體，升高溫度既需要較長的時 間，又需要很大的能源消耗，成本也很高。 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達： 攜帶包含大腸桿菌 lacZ 基因和異源啟動子的質(zhì)粒載體的不同革蘭氏陰性菌受體菌中測定的 ? 半乳糖苷酶活性 ? G al acto sidas e a cti vity (U) in : Promoter Escher ichia coli Rh i zobium melil oti Rh i zobium legumi no s arum Pseud omo na s pu ti d a None 16 110 130 150 Nm 1,40 0 21 , 800 13 , 900 16 , 300 lac 2,00 0 9,05 0 6,25 0 9,80 0 tac 11 , 300 2,85 0 1,15 0 2,95 0 S1 40 3,30 0 1,20 0 3,35 0 苜蓿根瘤菌 豌豆根瘤菌 惡臭假單胞菌 大腸桿菌 ?半乳糖苷酶在不同受體菌中的表達分析： (1) 所有啟動子在受體菌中都有一定的活性； (2) tac啟動子在大腸桿菌中活性最高，但是在其它受體菌中活性最低； (3) 新霉素基因啟動子（ Nm）是在大腸桿菌中活性最低的啟動子，但是在其它受體菌中驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的活性卻最高。 表達非融合蛋白，一般要求其編碼基因的 ATG起始位點與核糖體結(jié)合位點（ RBS）之間的距離要合適，否則即使僅相差 2~3個 bp，表達效率也會大受影響。 不利方面： 容易受到受體菌蛋白酶的降解，產(chǎn)量較低。 （ 3）用蛋白酶抑制劑。 融合蛋白的表達 1. “三夾板”式融合 2. 3. C末端融合 N末端融合 運載蛋白 運載蛋白 異源功能蛋白 運載蛋白 運載蛋白 異源功能蛋白 異源功能蛋白 通過在細胞膜跨膜蛋白中“鑲嵌”外源蛋白，是一種典型的 “三夾板”式融合方式 pPC?系列載體： pPC???Z1， pPC???Z2和 pPC???Z3。 融合蛋白的純化 將融合蛋白分割成宿主蛋白和外源蛋白的策略： （ 1）在融合蛋白和宿主
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