western-blot實(shí)驗(yàn)方法步驟-wenkub
2023-05-22 00:51:02 本頁(yè)面
【正文】 公司） ? 兔抗大鼠 Glut 1多克隆抗體（ Santa Cruz公司） ? PhototopeHRP Western Blot Detection System（ Cell Signaling Technology公司） 儀器與設(shè)備 ? 低溫超速離心機(jī)（ Eppendorf公司） ? 分光光度計(jì)（ Eppendorf公司） ? Thermomixer（ Eppendorf公司） ? 電泳儀（ BioRad 公司） ? 垂直式電泳槽（ BioRad 公司） ? 硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（ BioRad 公司） 配制試劑 ? 10 電泳 Buffer 稱取 Trisbase glycine 144克 加去離子水，定容至 1000ml SDS 10克 ? PH 稱取 Tris，加 60ml ddH2O溶解，調(diào) PH至 ，定容 100ml ? 稱取 Tris，加 60ml ddH2O溶解，調(diào) PH至 ，定容 100ml ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液 稱取 ， Glycine，用 ddH2O溶解，定容至800ml，臨用前加 200ml甲醇 10*： ， 144克 Glycine，用 ddH2O溶解，定容至800ml。插得深不起泡沫。分成三層：上層為油脂，中層為蛋白質(zhì)，下層為沉淀。 細(xì)胞準(zhǔn)備 ? 用 PBS洗兩次細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，用橡膠刮子刮下細(xì)胞，由于染色體 DNA的釋放，溶液變得很粘稠。 ? 2 酵母先用玻璃珠振蕩法或酶法裂解細(xì)胞，然后制備提取液。細(xì)胞表面蛋白和分泌蛋白通常比細(xì)胞內(nèi)蛋白具有更好的抵抗力，變性蛋白比天然蛋白更容易降解。 ? 被廣泛地用于蛋白質(zhì)研究，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。Westernblot 試驗(yàn) 概論 ? 它結(jié)合了凝膠分辨力高和固相免疫測(cè)定的特異敏感等多種優(yōu)點(diǎn)，與免疫沉淀法比較，這種方法無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行同位素標(biāo)記。 溶解蛋白策略 ? 1 使用劇烈的條件以確保細(xì)胞蛋白能全部裂解下來(lái)，但這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)性的丟失。 ? 往往可以根據(jù)靶蛋白的特性而不是所用抗血清的性質(zhì)來(lái)調(diào)整提取的條件。 ? 3 哺乳動(dòng)物組織通常可以機(jī)械分散并直接溶于 SDS凝膠加樣緩沖液。吸入 。 ? 有必要時(shí)重復(fù)上一步驟。 ? 檢測(cè)蛋白的敏感性 1－ 5ng, SDS－ PAGE的一個(gè)孔大約上 100ug的總蛋白。 配制試劑 ? 30％ AcryBis 29克丙烯酰胺＋ 1克雙丙烯酰胺，加 ddH2O 100ml配成，避光 4℃ 保存 ? 10％過(guò)硫酸胺，新鮮配制， 1week ddH2O 1ml配成， 4℃ 保存 ? 封閉試劑 10 TBS （應(yīng)用液： 1 TBS） 10 TBS：取 Tris－ Base 80克氯化鈉 用800mlddH2O溶解后，用 HCl調(diào) PH至 ，定容至1000ml 1 TBS：取 10 TBS 50ml，稀釋至 500ml，臨用前加 ％ Tween 20， 500ul。 ? 多克隆抗血清是由單一免疫球蛋白組成的不確定混合物，通常對(duì)其特異性、親和力以及濃度都一無(wú)所知。再鋪 4%積層膠，注意不要產(chǎn)生氣泡，斜插上梳子，待膠干后備用，拔去梳子。 ? 封
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