westernblot實(shí)驗(yàn)步驟-wenkub
2023-05-22 00:52:23 本頁面
【正文】 物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 ? 貼壁細(xì)胞 ：細(xì)胞可以在培養(yǎng)皿里裂解，洗掉培養(yǎng)基， PBS洗 2~3次，加入 RIPA裂解液裂解，以可以將細(xì)胞消化下來，離心， PBS洗 2~3次，加入 RIPA冰上裂解液裂解 30分鐘（可提高蛋白濃度）。 顯影 (ECL法 )： 將 A、 B發(fā)光液按比例稀釋混合均勻滴在膜上。 轉(zhuǎn)膜： 半干或濕轉(zhuǎn)，應(yīng)用半干法轉(zhuǎn)膜需防止短路。 ? 由于 Western blot檢測技術(shù)具有簡便，快捷等特點(diǎn)，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 Western Blot 信號放大基本原理 經(jīng)過 SDSPAGE分離的蛋白質(zhì)、多肽等被轉(zhuǎn)移到固相支持膜上，然后用蛋白質(zhì)或多肽特異性的抗體來檢測 一級信號放大 二級信號放大 一抗 抗原 抗原 一抗 二抗 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 Western Blot一般流程 底片掃描、分析 底物顯色 二抗孵育 一抗孵育 封閉 轉(zhuǎn)膜 SDSPAGE電泳 蛋白樣品的制備 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 Western Blot基本實(shí)驗(yàn)步驟 蛋白質(zhì)提取： WIP或 RIPA裂解細(xì)胞或研磨組織，離心，收集上清。 封閉： 5%脫脂奶粉或 BSA封閉過夜或室溫 1小時(shí)。置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。按 6孔板 100200微升 /孔的比例加入 PIPA(可根據(jù)細(xì)胞多少調(diào)節(jié)裂解液體積） , 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 15分鐘，收集上清 . ? 懸浮細(xì)胞 : 收集培養(yǎng)細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，用 PBS洗 23遍，按 6孔板加入 100200微升 /孔的比例加入 RIPA，用搶懸浮細(xì)胞。反應(yīng)化合物在 595nm處有最大光吸收值，化合物顏色的深淺
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