westernblot實(shí)驗(yàn)步驟-文庫吧
2025-04-21 00:52 本頁面
【正文】 T洗膜 3次，每次 5分鐘。 二抗孵育： 5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育 1小時(shí)， 1x TBST，洗膜 3次，每次 5分鐘。 顯影 (ECL法 )： 將 A、 B發(fā)光液按比例稀釋混合均勻滴在膜上。置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中 12min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干。 圖片分析： 標(biāo)定 Marker，進(jìn)行分析與掃描 。 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 ? 貼壁細(xì)胞 ：細(xì)胞可以在培養(yǎng)皿里裂解，洗掉培養(yǎng)基， PBS洗 2~3次，加入 RIPA裂解液裂解，以可以將細(xì)胞消化下來，離心， PBS洗 2~3次，加入 RIPA冰上裂解液裂解 30分鐘（可提高蛋白濃度）。按 6孔板 100200微升 /孔的比例加入 PIPA(可根據(jù)細(xì)胞多少調(diào)節(jié)裂解液體積） , 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 15分鐘，收集上清 . ? 懸浮細(xì)胞 : 收集培養(yǎng)細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，用 PBS洗 23遍，按 6孔板加入 100200微升 /孔的比例加入 RIPA，用搶懸浮細(xì)胞。如果細(xì)胞數(shù)量較大，應(yīng)按 50100萬細(xì)胞 /管分裝或根據(jù)細(xì)胞數(shù)量按比例增加 RIPA的用量，裂解完全時(shí)應(yīng)無明顯的細(xì)胞顆粒。 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 15分鐘，收集上清 . ? 組織樣品 ：液氮研磨組織，按每 20毫克組織加 100200微升的比例加入 RIPA,冰上裂解 30分鐘， 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 30分鐘，收集上清 . 蛋白樣品的制備 輝駿生物： 免費(fèi)服務(wù)熱線： 4006991663 蛋白樣品的定量 Bradford法測定蛋白濃度 ? 原理： 此法基于考馬斯亮藍(lán) G250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在 595nm處有最大光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系。 ? 考馬斯亮蘭溶液的配制： 稱取 100mg考馬斯亮藍(lán)
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