westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)(1)-wenkub
2023-05-22 00:52:23 本頁面
【正文】 工作液混合； (3) 37度反應(yīng) 2hr； (4)測(cè)定 562nm處光密度 (OD)值 。 Western Blot 信號(hào)放大基本原理 在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測(cè)。 ? 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法 。 ? 而后人們用類似的方法，對(duì) RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì) RNA的印跡分析稱為 Northern印跡 法，對(duì) 單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。 Western Blot一般流程 底片掃描、分析 底物顯色 二抗孵育 一抗孵育 封閉 轉(zhuǎn)膜 SDSPAGE電泳 蛋白樣品的制備 ? 培養(yǎng)細(xì)胞 ：洗掉培養(yǎng)基， PBS洗 2~3次，加入裂解液，用細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞刮下，超聲波勻漿器勻漿，冰上靜置 30分鐘， 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 15分鐘，收集上清 . ? 組織樣品 ：快速取材、液氮速凍、按每 80毫克組織加 1毫升的比例加入裂解液 ,超聲波勻漿器勻漿，靜置 60分鐘， 4度， 12021轉(zhuǎn)，離心 15分鐘，收集上清 . ? 樣品保存：避免反復(fù)凍融樣品， EP管分裝 20度保存，不要超過 2周，最長(zhǎng)不要超過 1個(gè)月； 80度（或 70度）保存，一般不超過半年，最多 1年。 (4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算蛋白濃度 SDSPAGE（ polyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ) 原理 ： 聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ， 具有 分子篩效應(yīng) . SDS （ 十二烷基硫酸鈉 ） 是一種離子性的界面活性劑 ,它有 強(qiáng)離子性 的硫酸根離子也帶有 疏水性 的長(zhǎng)碳鏈 .當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí) ,它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來 ,而以硫酸根離子外露與水分子作用 .大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1: (以重量為單位 ),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的 SDS后後 ,由于 SDS 帶強(qiáng)負(fù)價(jià) ,使蛋白質(zhì)原先的帶電價(jià)微不足道 ,且每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價(jià)一致 (charge density),所以 決定不同蛋白的泳動(dòng)速率就只剩下分子大小一項(xiàng)因素 。分離膠是由 APS催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為 TrisHCl。 2）強(qiáng)還原劑：如 beta巰基乙醇或 DTT（二硫蘇糖醇），能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂 3）溴酚藍(lán)：指示劑 ? 步驟： 混勻、沸水煮 5min， 4度離心，置冰上備用。靈敏度為 ／每條帶。 （ 2） Western Blot一般上樣 30－ 100微克不等 ， 結(jié)果跟目的蛋白的含量 、 上樣量 、 一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系 ， 也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān) 。 （ 4） pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的 ， 在
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