westernblot詳解及問題分析-wenkub
2023-05-22 00:44:30 本頁(yè)面
【正文】 目的蛋白的表達(dá)特性分析 ? 目的蛋白與其它蛋白的互作 ? 目的蛋白的組織定位 ? 目的蛋白的表達(dá)量分析 Western Blot Western Blot 流程 ?蛋白樣品的制備 ?SDSPAGE ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 Western Blot ? 通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 ? 水溶液提取法 針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及 常見問題分析 張紹進(jìn) Western Blot ? Western Blot簡(jiǎn)介 ? Western Blot一般流程 ? Western Blot常見問題分析 Western Blot Western Blot 簡(jiǎn)介： ? 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測(cè)定樣品濃度。 ? 蛋白質(zhì) SDS膠束所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不 同分子之間原有的電荷差異。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 Western Blot SDSPAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入 SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液， SDS是一種很強(qiáng)的 陰離子表面活性劑 ，它可以 斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵 ，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。 蛋白質(zhì)分子結(jié)合 SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超 過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所 帶凈電荷的差異。是良好的電泳介質(zhì)。 Western Blot 灌制分離膠 隔絕空氣 ddH2O %SDS:8% 異丁醇： 8% Western Blot 灌制積層膠 插入梳子 Western Blot Staking gel Separating gel Western Blot 轉(zhuǎn)膜 ? 要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例如 NC膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法 。尼龍膜和 NC膜的特點(diǎn)相似 ,主要用于核酸雜交。 ? 5%脫脂奶粉或 BSA（室溫孵育 1h） ? Western Blot 膜封閉液（生物試劑公司） ? Tween20的作用：減少非特異性吸附，不影響抗體與抗
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