【正文】 建載體及獲得所有需要的轉(zhuǎn)基因動物。這些前期工作基礎(chǔ)是確保項目順利實施和取得成功的最關(guān)鍵因素。 4）可 行性分析： 1. 本項目的總體目標和研究方案切實可行，在我們已經(jīng)取得的研究成果基礎(chǔ)上重點研究感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預(yù)措施，整體提高我國感音神經(jīng)性聾防治的科學(xué)研究水平。 3) 創(chuàng)新點與特色： 1. 圍繞“毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關(guān)鍵科學(xué)問題，對我國感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預(yù)措施開展具有世界前沿水平的研究； 2. 在研究內(nèi)容和思路上，從核酸 、蛋白、細胞及耳蝸結(jié)構(gòu)等不同層面，針對我國常見感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制展開研究，闡明遺傳因素、環(huán)境因素（噪聲、耳毒性藥物、感染等）和老化因素導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的途徑及其相互作用機制，建立有效的耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元保護措施和探索生物學(xué)重建耳蝸功能的途徑。 6. 激活耳蝸毛細胞再生的研究 1）調(diào)控細胞周期因子激活耳蝸毛細胞再生：構(gòu)建 病毒載體，研究轉(zhuǎn)基因技術(shù)過量表達 raf1 基因在體外毛細胞損傷模型上誘導(dǎo)耳蝸感覺上皮細胞再生情況；研究耳蝸再生細胞分化為毛細胞和支持細胞的能力以及過量表達raf1 基因后耳蝸殘存細胞 Rb 基因表達，并檢測 pRb 蛋白表達及其磷酸化情況，研究毛細胞再生的機制。 （ 2） 采用膜片鉗技術(shù)結(jié)合 FM143 熒光染色技術(shù)鑒定干細胞源毛細胞的功能。 （ 2） 研究各模型（ CD 大鼠， C57BL/6 小鼠和 DBA/2J 小鼠）內(nèi)耳酶功能及神經(jīng)生理學(xué)改變。 （ 2） 調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)與毛細胞損傷保護，以及抗凋亡基因 XIAP 耳蝸局部轉(zhuǎn)染對耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護作用。以 EVA 耳聾動物模型 SLC26A4/基因敲除小鼠為對象，針對 SLC26A FOXI KCNJ10 三個靶基因進行基因糾正的實驗研究。 2）常見耳聾相關(guān)基因致聾機制：應(yīng)用 RNAi 技術(shù)、鋅指核酶技術(shù)、精原細胞注射技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究我國常見耳聾相關(guān)基因（ Connexin 基因、 EVA 相關(guān)基因 SLC26A4 和 Foxi1 等）突變所致耳蝸內(nèi)環(huán)境平衡紊亂的機制及毛細胞功能障礙。 2） 遺傳性耳聾基因型和聽力表型的相關(guān)研究：聯(lián)合耳聾基因篩查與聽力篩查，通過對多種聾病表型（如耳聾發(fā)病時間、聽力損失程度、受環(huán)境因素影響等）的歸類研究建立不同遺傳性耳聾的基因型 表型關(guān)聯(lián)聯(lián)系。毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷保護及功能重建：建立安全有效的耳蝸基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，探索保護耳蝸毛細胞免于損傷的抗凋亡等理論與技術(shù)；探索轉(zhuǎn)基因策略修復(fù)基因缺陷所致耳蝸毛細胞損傷的機制；采用聲刺激誘導(dǎo)植入耳蝸的經(jīng)過基因修飾的干細胞定向分化，研究植入干細胞定向分化為毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的分子機制，探索細胞替代策略重建聽覺功能的有效途徑；通過調(diào)控細胞周期 因子激活耳蝸毛細胞再生，鑒定再生毛細胞的功能，為細胞再生途徑重建聽覺功能提供理論依據(jù)。 6. 爭取獲得 12 項國家級科技進步獎?？傮w提高我國在感音神經(jīng)性聾的基礎(chǔ)研究和臨床防治研究的國際競爭力。 五年預(yù)期目標 : 1. 闡明遺傳、環(huán)境和老化等因素導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾的機制及各種有害因素在致聾機制中的相互作用； 2. 為建立規(guī)范化的遺傳性聾產(chǎn)前診斷和老年性聾早期分子診斷技術(shù)及預(yù)防體系提供實驗依據(jù)； 3. 建立耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的保護措施及 干預(yù)感音神經(jīng)性聾的生物學(xué)技術(shù)和理論； 4. 培養(yǎng)一批我國具有國際競爭力的優(yōu)秀聽覺醫(yī)學(xué)研究人才，以六個課題單位為基地，預(yù)計培養(yǎng)國家杰出青年科學(xué)基金獲得者、教育部“長江學(xué)者特聘教授”和中科院“百人計劃”入選人才共 35 名；教育部“新世紀人才計劃” 68 名。 三、研究方案 1）學(xué)術(shù)思路： 本項目圍 繞“毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷機制、保護措施及功能重建”這個感音神經(jīng)性聾防治的關(guān)鍵科學(xué)問題，探索感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及有效的干預(yù)措施，研究重點是揭示重度感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制、病理生理過程及生物學(xué)干預(yù)策略。通過本項目的系統(tǒng)研究，以期闡明我國常見感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機制及病理生理過程，為建立遺傳性聾產(chǎn)前診斷和老年性聾分子診斷技術(shù)奠定基礎(chǔ)，探索耳蝸毛細胞保護和聽覺功能重建生物學(xué)技術(shù)，為提高我國感音神經(jīng)性聾的防治水平提供理論依據(jù)。 3）研究遺傳性聾規(guī)范化產(chǎn)前診斷技術(shù)：以母體外周血胎兒細胞分離與胎兒 DNA富集為研究重點，開發(fā)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)；結(jié)合產(chǎn)前診斷需求和 高通量基因篩查技術(shù)平臺，研究并初步建立規(guī)范性聾病產(chǎn)前診斷體系，對其模式、效果進行評估。 3）轉(zhuǎn)基因技術(shù)糾正遺傳缺陷所致耳聾的實驗研究： （ 1） 干預(yù) Connexin 基因突變導(dǎo)致耳聾的實驗研究。 3. 耳蝸毛細胞損傷及保護機制的研究 1）耳蝸損傷機制研究：以毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元線粒體為核心，觀察不同環(huán)境因素作用下毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元死亡形式及相關(guān)信號途徑的活化，研究耳蝸毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡途徑。 （ 3） RNA 干擾對毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元損傷的保護作用。 （ 3） 以線粒體基因組為核心，研究核基因和線粒體基因相互作用的機制及發(fā)現(xiàn)新的基因突變；研究調(diào)控蛋白質(zhì)輸入及抗氧化劑對線粒體缺失大鼠模型耳蝸損傷的保護機制；研究 mtDNA4834bp 缺失模型中相關(guān)氧化磷酸化在耳蝸毛細胞損傷中的作用及其機制； （ 4） 建立 CD 缺失的邊緣細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞系，研究老年性聾相關(guān)基因及抗衰老基因與 CD 的相互作用及機制。以膜片鉗技術(shù)檢測 EGFP 陽性的干細胞源毛細胞電生理特征，并用毛細胞標志物標記確認毛細胞，結(jié)合毛細胞離子通道特征、毛細胞換能和適應(yīng)性及非特異性離子通道鑒定干細胞源毛細胞的功能。 2）同時轉(zhuǎn)染激活前體細胞增殖和促毛細胞分化基因激活毛細胞再生：采用已構(gòu)建的 腺病毒載體，觀察過量表達 Pax2 及 Math1 基因?qū)Τ赡晔蠖佒С旨毎鲋澈头只挠绊?，試圖過量表達 Pax2 激活支持細 胞增殖，同時在增殖細胞中表達 Math1 誘導(dǎo)增殖細胞向毛細胞分化，從而誘導(dǎo)成年鼠耳蝸毛細胞再生。致聾機制研究和有效的干預(yù)措施研究并重，通過機制研究的結(jié)果為干預(yù)措施提供依據(jù)； 3. 在研究策略上，采用基礎(chǔ)研究結(jié)合臨床研究的策略，重點研究關(guān)鍵的科學(xué)核心問題，為建立我國常見感音神經(jīng)性聾的早期診斷、有效的預(yù)防及生物學(xué)干預(yù)措施提供理論依據(jù)； 4. 在臨床資源上 ，課題組單位有 3 個國家耳鼻喉科重點學(xué)科、一個衛(wèi)生部聽覺醫(yī)學(xué)重點實驗室及一個衛(wèi)生部新生兒聽力篩查中心（已建立全國新生兒聽力篩查網(wǎng)絡(luò)），我們已經(jīng)擁有了龐大的感音神經(jīng)性聾家系的 DNA 樣本庫。 2. 在理論方面，本項目提出的關(guān)鍵科學(xué)問題和科研思路具有科學(xué)依據(jù)，代表了世界上感音神經(jīng)性聾發(fā)病機制及干預(yù)措施研究最為前沿和關(guān)鍵的科學(xué)問題。 4. 在技術(shù)方面，研究方案中涉及的基因芯片技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、干細胞定向分化技術(shù)、耳蝸細胞增殖和分化研究方法、細胞凋亡、毛細胞單細胞生理、聽覺功能鑒定等實驗技術(shù)已為申請者熟練掌握，已經(jīng)成為各相關(guān)課題組的常規(guī)實驗技術(shù)和方法， 這些實驗技術(shù)的掌握是保證本項目順利進行的基礎(chǔ)。 啟動研究項目，初步匯總各單位生物資源庫，完善建立的出生缺陷平臺資源 第二年 在已經(jīng)收集的遺傳性聾大家系中，運用大家系連鎖定位分析，基因組關(guān)聯(lián)分析，基因功能性克隆等策略發(fā)現(xiàn)新耳聾相關(guān)基因和相關(guān)突變，研究核基因和線 粒體基因組在耳聾發(fā)病過程中所起的作用，研究調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體MPTP 狀態(tài)、凋亡信號途徑及其相應(yīng)的 miRNA 調(diào)控等層面篩選 并發(fā)現(xiàn) 出 35 個感音神經(jīng)性聾易感基因，啟動基因型 表型關(guān)聯(lián)研究； 新耳聾基因功能鑒定； 研究毛細胞損傷機制，獲取 35個關(guān)鍵因子或 miRNA， 發(fā)表 SCI 文章 510 篇，申請專利24 項 系統(tǒng)研究毛細胞損傷的途徑和分子機制； 第三年 完成 我國常見耳聾相關(guān)基因的功能 的研究及 耳聾相關(guān)基因（ GJB 基因突變、大前庭水管綜合癥等）的致聾機制；在調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體MPTP 狀態(tài)、凋亡信號 途徑及其相應(yīng)的 miRNA 調(diào)控等不同層面保護毛細胞免于損傷，重點研究抗凋亡策略保護毛細胞慢性損傷 ，毛細胞再生及干細胞移植實驗。 獲得國家發(fā)明專利或國際專利45 項，發(fā)表 SCI 論文 10 篇，爭取 國家級獎勵 12 項。重點研究耳聾基因?qū)е轮囟雀幸羯窠?jīng)性聾及先天性聾的發(fā)病機制，同時探索致聾基因之間的相互關(guān)系及相互作用。闡明環(huán)境因素、核基因背景和線粒體突變異質(zhì)性在耳聾發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用及機制。 2) 人遺傳性耳聾鼠模型（ Mouse models of human deafness）轉(zhuǎn)基因干預(yù)實驗研究：通過轉(zhuǎn)染正常（野生型）基因，使之在耳蝸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定表達，發(fā)揮基因的正常功能，糾正遺傳缺陷所致耳聾。 4) 激活耳蝸毛細胞再生重建聽覺功能的實驗研究：毛細胞不能自發(fā)再生是感音神經(jīng)性聾防治難題的關(guān)鍵，擬通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在損傷耳蝸轉(zhuǎn)入調(diào)控 細胞周期的關(guān)鍵因子。 二、 創(chuàng)新點和特色 課題的主要創(chuàng)新點和特色包括 以下 6 個方面： 本課題提出視 覺信號處理傳遞和加工異常導(dǎo)致近 視 的關(guān)鍵科學(xué)問題，并圍繞此科學(xué)問題展開 6 個方向的研究，研究其在近視形成和并發(fā)癥出現(xiàn)上的作用及其機制，從設(shè)計上體現(xiàn)出創(chuàng)新性和特色。本項目依托由陳潤生院士領(lǐng)導(dǎo)的中國科學(xué)院生物物理研究所生物信息學(xué)實驗室，該實驗室是國內(nèi)最早從事生物信息學(xué)和基因組學(xué)研究的實驗室之一。涉及的技術(shù)包括免疫組化，激光共聚焦技術(shù)，各種模式膜片鉗，鈣成像，微透析技術(shù)及高效 液相層析分析 ； 應(yīng)用的標本有灌流視網(wǎng)膜鋪片，視網(wǎng)膜薄片，單個分離細胞，培養(yǎng)細胞等，從而有可能對研究主題形成較完整，深入的認識，體現(xiàn)了現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)的特點。 此項目利用前期發(fā)現(xiàn)的多巴胺在近視中的作用，并深入研究其機制，具備明顯的優(yōu)勢和特色。磁共振成像和高分辨腦電、透顱磁刺激、眼動等結(jié)合，和認知科學(xué)和心理學(xué)行為實驗系統(tǒng)、計算系統(tǒng)配套，形成了一個具備高時間分辨率和高空間分辨率的 中樞分析平臺。這對研究人眼調(diào)節(jié)機制，克服傳統(tǒng)眼科 儀器在調(diào)節(jié)研究領(lǐng)域存在的應(yīng)用困難具有重要意義。 研究目標： 建立一個 有足夠樣本數(shù)同時穩(wěn)定的學(xué)齡期 兒童近視研究隊列，搜集和篩選與我國學(xué)齡期兒童近視發(fā)生發(fā)展相關(guān)的各種因素，尤其是關(guān)鍵環(huán)境因素，動態(tài)觀察學(xué)齡期兒童近視的發(fā)展規(guī)律，探索近視的發(fā)生及進展的機制。 研究目標： 利用各種近視動物模型及基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠，明確近視發(fā)生發(fā)展過程中多巴胺能無長突細胞的改變，多巴胺能無長突細胞胞外的多 巴胺濃度的改變及其與近視發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及多巴胺合成、代謝、轉(zhuǎn)運等各環(huán)節(jié)上的改變，明確近視對小鼠多巴胺能無長突細胞自發(fā)放電、對光反應(yīng)、膜電位、受體和轉(zhuǎn)運體的影響，以及對視網(wǎng)膜神經(jīng)元之間信號通路的影響；進一步確定多巴胺能無長突細胞在近視的發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其生理機制，明確 D1受體和 D2受體在近視形成中的作用，從而進一步闡明 DA神經(jīng)遞質(zhì)在近視中的機制。 研究目標：