【正文】 基因工程 上、下游技術(shù) ? 定義：基因工程技術(shù)是指將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。 ? 基因工程藥物制造的一般流程： ? （ 1）獲得目的基因；（ 2） 組建重組質(zhì)粒；（ 3）構(gòu)建基因工程菌；（ 4）培養(yǎng)工程菌；（ 5）產(chǎn)物分離純化；（ 6）除菌過濾；（ 7）半成品檢定；（ 8）包裝 ? 上游階段：首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。其中的 (1)、 (2)、 (3)步驟屬于上游階段，在實(shí)驗(yàn)室完成。 ? 下游階段：將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度純品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計和制造，電子計算機(jī)的優(yōu)化控制等。上述 (4)、 (5)、 (6)、 (7)、 (8)屬于下游階段。 一：基因工程技術(shù)主要內(nèi)容 1. 獲得具有遺傳信息的目的基因 2. 選擇基因載體獲得重組 DNA 3. 將重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 4. 鑒定帶有目的基因的克隆 5. 目的基因的擴(kuò)增及獲得目的產(chǎn)物 獲得具有遺傳信息的目的基因 ? 1 鳥槍克隆法 ? 2 人工合成目的基因 ? 酶促方法 ? 化學(xué)合成法 ? 聚合酶鏈反應(yīng) (PCR) 2 選擇基因載體獲得重組 DNA ? 在體外將含目的基因的 DNA 片段和具有自我復(fù)制功能、并帶有選擇標(biāo)記的載體分子進(jìn)行酶切連接 , 獲得重組 DNA 分子?？梢宰鳛檩d體的主要有質(zhì)粒、噬菌體 (phage) 、黏粒 (cosmid) 、病毒載體等。 3 將重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞 ? 采用特定的方法將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)受體細(xì)胞 (也稱寄主細(xì)胞 ), 并與之同步增殖。被導(dǎo)入的受體細(xì)胞分為兩大類：第一類為原核細(xì)胞 ,目前常用的有大腸桿菌、枯草芽 抱桿菌、鏈霉茵等。第二類為真核細(xì)胞 , 其中真核微生物主要有酵母、絲狀真菌等 , 此外為動物細(xì)胞、植物細(xì)胞。另外也可以導(dǎo)人動物和植物體。 ? 導(dǎo)人的方法主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等方法 , 此外也可采用電融合、顯微注射和基因槍等技術(shù)。 4 鑒定帶有目的基因的克隆 ? 從大量的細(xì)胞繁殖群體中 ,篩選出克隆有重組 DNA分子的寄主細(xì)胞。為了挑選出重組子 ,針對不同基因的表達(dá)產(chǎn)物 ,采用各自特有的測活方法確定其生物活性 。也可以采用酶聯(lián)免疫方法確定其抗原性 。以目的基因?yàn)樘结?,通過 DNA雜交方法可以直接確定重組子。 5 目的基因的擴(kuò)增及獲得目的產(chǎn)物 ? 培養(yǎng)克隆有目的基因的重組子 ,提取獲得擴(kuò)增的目的基因以進(jìn)行深入的研究。將目的基因克隆至適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體 ,采用特定的方法將基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ,使其在新的遺傳背景下獲得活性表達(dá) ,從而得到人類需要的特定目的物質(zhì)。 二：基因工程上游技術(shù)的主要內(nèi)容 ? 1 聚合酶鏈反應(yīng) ? 2 DNA的序列測定 ? 3 基因文庫的構(gòu)建 1 聚合酶鏈反應(yīng) ? 聚合酶鏈反應(yīng)即 PCR (polymerase chain reaction) 技術(shù) ,1983年由美國 Mullis發(fā)明 ,是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA序列的方法 ,該技術(shù)的發(fā)明對分子生物學(xué)發(fā)展起到極大的推動作用 ,發(fā)明者獲得了 1993年度諾貝爾化學(xué)獎。 PCR技術(shù)的基本原理 ?DNA是雙螺旋分子 ,在高溫條件下雙鏈會發(fā)生分離成為單鏈 DNA分子 ,DNA聚合酶以單鏈 DNA分子為模板 ,在與待擴(kuò)增 DNA片段兩端序列互補(bǔ)人工合成的引物及 4種脫氧核苷三磷酸的存在條件下 ,合成新的 DNA互補(bǔ)鏈 ,該鏈的起點(diǎn)取決于一對寡核苷酸引物在模板 DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)。兩條 DNA單鏈均可成為合成新互補(bǔ)鏈的模板 ,鑒于引物是依擴(kuò)增段兩端序列互補(bǔ)原則設(shè)計的 ,因此每一條新生鏈的合成均起始于引物的退火位點(diǎn) ,繼而沿相反鏈延伸 ,因此每條新合成 DNA鏈均具有新的引物結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)再度加熱高溫條件下 ,使新舊 DNA雙鏈分開 ,重復(fù)下一輪的循環(huán)反應(yīng) ,經(jīng)過多次循環(huán)后反應(yīng)體系中雙鏈 DNA分子數(shù) ,即一對引物結(jié)合位點(diǎn)間 DNA片段的拷貝數(shù)理論上可達(dá) 2n 。 PCR反應(yīng)主要分為 3個部分進(jìn)行 ? (1)模板變性 ? (2)退火 ? (3)延伸 ? 上述 3個步驟構(gòu)成一個循環(huán) ,每一循環(huán)的產(chǎn)物將成為下一循環(huán)擴(kuò)增的模板 ? 解釋：雙鏈 DNA在 90～ 95℃ 變性；再迅速冷卻至 40 ～ 60℃ ，引物退火并結(jié)合到靶序列上；然后快速升溫至 70～ 75℃ ，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。 ? 下面是一個參考程序循環(huán)： 預(yù)變性 94℃ 4分鐘，循環(huán) 1次 (1) 變性 94℃ 1分鐘 ? (2)退火 54℃ 1分鐘 延伸 72℃ 1分鐘 循環(huán) 30次 (3)終延伸 72℃ 7分鐘 循環(huán) 1次 耐熱 DNA聚合酶 ? Taq DNA聚合酶 ： 1988年 Saiki等人將 Taq DNA聚合酶成功應(yīng)用于 PCR擴(kuò)增技術(shù)。 ? Tth DNA聚合酶是由嗜熱水生菌 ? Tli DNA聚合酶 ? PfuDNA聚合酶 Taq DNA polymerase ? Taq DNA聚合酶 (Taq DNA polymerase)是從嗜熱水生菌 (Thermus aquaticus)中分離獲得的 ,該酶基因全長 2496個堿基對 ,編碼 832個氨基酸 ,酶蛋白相對分子量為 104,在 70~75℃ 活性最高 ,即或在 95℃ 高溫仍具有活性 ,因此無需在每一循環(huán)反應(yīng)中再加酶。在正常反應(yīng)條件下 ,經(jīng)過 25~30個擴(kuò)增循環(huán) (即擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到106)后 ,Taq DNA聚合酶量便成為了反應(yīng)進(jìn)行的制約因素 ,如需繼續(xù)擴(kuò)增 ,要將產(chǎn)物 DNA樣品稀釋1000~10000倍 ,作為模板再進(jìn)行新的 PCR擴(kuò)增反應(yīng)。和其他聚合酶一樣 ,TaqDNA聚合酶也是 Mg2+依賴酶 ,對 Mg2+濃度十分敏感。 Pfu DNA聚合酶 ? Pfu DNA聚合酶是從嗜熱菌 Pyrococcus furiosis中分離得到的 ,稱高保真耐高溫 DNA聚合酶 ,能夠糾正 PCR擴(kuò)增中發(fā)生的核昔酸錯誤。該酶比 Taq DNA聚合酶及其變體錯誤率低 10倍 ,Pfu DNA聚合酶的超常糾錯功能是由該酶性質(zhì)決定的 ,其他耐熱 DNA聚合酶與 Pfu DNA聚合酶合用可以部分降低錯誤率 ,但達(dá)不到單獨(dú)使用該酶的效果。然而 Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增率低于 Taq DNA聚合酶 ,這是由于該酶具有 339?！?539。外切酶活性。 引物設(shè)計 ? 引物 (primer)是指與待擴(kuò)增靶 DNA區(qū)兩端序列互補(bǔ)的人工合成寡核苷酸片段 ,包括引物 1和引物 2,引物1稱為 Watson引物 ,是 539。端與正義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸 ,用于擴(kuò)增編碼鏈或 mRNA鏈 。引物 2稱為 Crick引物 ,是 339。端與反義鏈互補(bǔ)的寡核苷酸 ,用于擴(kuò)增DNA模板鏈或反密碼鏈。 PCR擴(kuò)增成功的關(guān)鍵因素之一是引物的設(shè)計 ,它將直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的大小、位置及擴(kuò)增區(qū)的 Tm值。引物設(shè)計的目的是要在擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率間取得平衡。 1. 引物的長度一般以 15~30bp為宜 ,兩個引物與模板 DNA結(jié)合點(diǎn)間的距離決定了待擴(kuò)段的長度。 2. GC含量和 Tm,一般認(rèn)為 G+C含量在 45%~55%較好。 3. 引物末端的核苷酸 4. 引物與非擴(kuò)增區(qū)的同源性 5. 簡并引物 6. 嵌套式引物 PCR技術(shù)的新進(jìn)展 1. 反向 PCR (inverse PCR,IPCR) 2. 反轉(zhuǎn)錄 PCR(RTPCR) 3. 定量 PCR 4. DNA單鏈構(gòu)象多態(tài)性 PCR 5. 不對稱 PCR (asymmet