【正文】 2023年 3月 15日星期三 12時 12分 29秒 00:12:2915 March 2023 ? 1一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。勝人者有力，自勝者強。 , March 15, 2023 ? 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 。 :12:2900:12Mar2315Mar23 ? 1世間成事，不求其絕對圓滿，留一份不足，可得無限完美。 2023年 3月 15日星期三 12時 12分 29秒 00:12:2915 March 2023 ? 1做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。 :12:2900:12:29March 15, 2023 ? 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 , March 15, 2023 ? 雨中黃葉樹，燈下白頭人。其他的蛋白雜質也要嚴格控制。 ? (1)目的蛋白質含量測定：通常采用的方法有還原性及非還原性 SDS－ PAGE法、等電點聚焦、各種HLPC、毛細管電泳 (CE)等。 ? (4)重組蛋白質的濃度測定和相對分子質量測定： ? 濃度測定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結合比色法、福林－酚法和紫外光譜法等。 ? 產品的鑒別 ? (1)肽圖分析：肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質 ,對生成的肽段進行分離分析。 ? 非蛋白質類雜質的去除 ? 非蛋白質類雜質不應忽視 ,在純化過程中 ,需特別注意3種可能存在的非蛋白類雜質 ,它們是 DNA、熱原質和病毒 ? (1)DNA的去除 ? (2)熱原質的去除 ? (3)病毒的去除 ? 四、選擇分離純化方法的依據 ? 根據產物表達形式來選擇 ? 根據分離單元之間的銜接選擇 ? 根據分離純化工藝的要求來選擇 第九節(jié) 基因工程藥物的質量控制 ? 一、原材料的質量控制 ? 原材料的質量控制是要確保編碼藥品的 DNA序列的正確性 ,重組微生物來自單一克隆 ,所用質粒純而穩(wěn)定 ,以保證產品質量的安全性和一致性。 ? (3)親和色譜是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附的 。 ? 選擇純化方法應根據目的蛋白質和雜蛋白的物理、化學和生物學方面性質的差異 ,尤其重要的是表面性質的差異。 ? 目的產物的分離純化 ? 主要依賴色譜分離方法。 ? (2)細胞破碎：有機械破碎法和非機械破碎法。 ? 物料中雜質的種類和性質 ? 目的產物特性 ? 產品質量的要求 ? 二、分離純化的基本過程 ? 分離純化是基因工程藥物生產中極其重要的一環(huán)。 第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化 ? 許多醫(yī)藥生物技術產品都是活性肽或蛋白質。 ? 誘導時機的影響 ? 一般在對數生長期或對數生長后期升溫誘導表達。溫度還影響蛋白質的活性和包含體的形成。接種量小 ,不利于外源基因的表達 ,大接種量有利于對基質的利用 ,縮短生長延遲期 ,并使生產菌能迅速占領整個培養(yǎng)環(huán)境 ,減少污染機會 ,但接種量過高又會抑制后期菌體的生長。 ? 常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。 ? 補料分批培養(yǎng) ? 將種子接入發(fā)酵反應器中進行培養(yǎng) ,經過一段時間后 ,間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基 ,使菌體進一步生長的培養(yǎng)方式。已有幾十種植物病毒被改造成不同類型外源基因表達載體 ,如椰菜花葉病毒 (CaMV)、煙草花葉病毒 (TMV)、區(qū)豆花葉病毒 (CPMV)等 ,其中采用 TMV載體已成功表達了超過 150種蛋白多肽。例如荷蘭 Phraming公司將乳鐵蛋白基因和促紅細胞生成素基因成功轉入牛乳腺 ,從而獲得了這兩種重組藥用蛋白；荷蘭還獲得了轉基因豬產生人凝血因子 Ⅷ 。 ? 腺相關病毒載體 (AAV)。 ? 哺乳動物細胞表達外源基因的主要優(yōu)點是能識別和剪切外源基因中的內含子并加工為成熟的 mRNA。⑨可懸浮培養(yǎng) ,適于規(guī)?；?,BmNPV宿主窄 ,家蠶易于飼養(yǎng) ,可以大規(guī)模元菌飼養(yǎng) ,便于大量表達異源基因。⑤表達水平較高 ,外源基因置于多角病毒蛋白啟動子控制下 ,由于啟動子強 ,使外源蛋白表達量可達細胞總蛋白的50%,最高的可達幾毫克 /毫升。 昆蟲細胞表達體系 ?①具有完整的感染性 ,昆蟲病毒載體的重組區(qū)是基因組的非必需區(qū) ,即使缺失也不會影響病毒的復制和表達 ,保持了昆蟲桿狀病毒載體的完整感染性。 2真核生物表達體系 酵母表達體系 ? 以往多采用釀酒酵母作為表達體系 ,但近年來已基本被畢赤酵母所替代 ? 作為表達體系該菌具有如下特點 :①是真核表達體系 ,對表達的蛋白可進行折疊和翻譯后修飾 。⑤表達的蛋白基本能正確折疊 ,不形成包含體 。④對發(fā)酵過程的有關遺傳和生理過程缺乏了解。⑨采用廉價的菌種保存方法菌種可有效生長。⑤已有許多有用的質粒載體。 大腸桿菌質粒載體 ? pSC101質粒載體 ? ColE1質粒載體 ? pBR322質粒載體 ? pUC質粒載體 芽孢桿菌 ? 優(yōu)點①采用天然感受態(tài)細胞容易進行轉化。 ? 其主要缺點在于 :缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng) ,特別是缺少糖基化功能 ,鑒于許多活性蛋白生物活性和糖基化密切相關 ,例如促紅細胞生成素 (EPO)不能在本體系進行表達 。近年來原核生物特別是大腸桿菌對基因工程的發(fā)展已經并繼續(xù)起到重要的作用 ,其他表達體系如芽孢桿菌、鏈霉菌等也有極大發(fā)展。可用于 DNA的 539。端標記前需用該酶脫磷。磷酸基 ,以防止片段間彼此相連。該酶催化反應時必須具備 DNA模板、 3’ OH的引物及其他必需因子 ,合成 DNA的方向是 5‘ → 3’。 DNA連接酶的底物可以是帶缺刻的 DNA、黏端 DNA或平端 DNA,連接效率依次降低。 λ噬菌體文庫的擴增 ? 將包裝混合液與適當菌體混合并涂布于NZCYM瓊脂平板 ,37℃ 培養(yǎng)約 10h,加入 噬斑稀釋緩沖液 (SM液 )收集擴增文庫。 ? 同聚尾克隆。 2. RNaseH酶降解取代法。由 12~20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)與 mRNA混合后同 poly(A)雜交 ,作為引物引導逆轉錄酶依 mRNA模板合成 CDNA第一條鏈 ,反應產物是一種 RNADNA雜交分子。從而可用核苷酸探針進行雜交篩庫的基因 。 CDNA文庫 ? 通過逆轉錄酶將各種 mRNA轉變?yōu)?CDNA,與適當載體連接重組后導入宿主保存 ,從而構建成包含某種生物所有基因編碼序列的 CDNA基因文庫。 ? 外源 DNA。 基因組文庫 ? 基因組文庫是包含有某物種全部基因隨機片段的重組DNA克隆的集合體。采用非同位素標記方法如洋地黃毒苷 (digoxigenin)標記、熒光標記和生物素標記等 ,目前測序主要采用熒光標記。的磷酸二酯鍵斷裂。 ? 其基本原理是用特定化學試劑處理末端標記的 DNA片段 ,形成對堿基的特異性切割 ,從而產生一組具有不同長度 DNA鏈的反應混合物 ,進行凝膠電泳后可根據 X光片顯示的相應條帶 ,讀出待測 DNA片段的序列。③采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離僅差一個核苷酸的單鏈 DNA。②能夠利用 2‘ ,3’ 雙脫氧核苷三磷酸作為底物 ,使之摻入到寡核苷酸鏈的 339。隨著 M13噬菌體和載體的發(fā)展 ,引物合成日漸方便及測序技術的日臻完善 ,目前主要采用 Sanger等發(fā)明的酶法測序。 2. Maxam及 Gilbert提出的化學降解法。這種技術已用于地中海貧血等疾病的基因診斷中。 4 DNA單鏈構象多態(tài)性 PCR ? DNA單鏈構象多態(tài)性是一種簡單易行鑒定擴增 DNA序列變化的技術 ,1989年 Orita等發(fā)現單鏈 DNA在進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時 ,遷移率與一級序列密切相關 ,這表明序列的微小變化會極大影響其構象。 3 定量 PCR ? 定量 PCR主要分為 DNAPCR和 mRNAPCR定量兩類。 2 反轉錄 PCR(RTPCR) ? 用于直接擴增經反轉錄為 CDNA的特定 RNA序列的 PCR方法稱為 RTPC方法。 1. 引物的長度一般以 15~30bp為宜 ,兩個引物與模板 DNA結合點間的距離決定了待擴段的長度。引物