基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略教材(已修改)
2025-01-15 17:43 本頁面
【正文】 1 基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略 Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes 分子生物學(xué)系 2 分子生物學(xué)的三大核心技術(shù) DNA序列分析 —DNA測序， 1977 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) —DNA擴(kuò)增， 1985 DNA重組技術(shù) —基因克隆， 1973 3 一、 DNA序列分析 二 、 核酸分子雜交 三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 四、 基因芯片和微陣列 五、 Western免疫印跡 主要內(nèi)容 4 （一） 雙脫氧末端終止法 (Sanger ,1977) 一、 DNA序列分析 （二） DNA自動(dòng)化序列分析 （三）化學(xué)降解法 (Gilbert ,1977) 5 Frederick Sanger 1918～ Walter Gilbert 1932～ The Nobel Prize in Chemistry 1980 Paul Berg 1926～ 6 DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)： 高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 技術(shù) ， 可分離 差別僅 1個(gè)堿基的單鏈寡核苷酸 DNA片段 。 7 (一）雙脫氧末端終止法 （ dideoxy chain termination） 8 ATP、 dATP和 ddATP的結(jié)構(gòu) ATP A OH OH H H dATP ddATP NTP: 核苷三磷酸 ATP、 GTP、 CTP、 UTP的合稱； dNTP: 脫氧核苷三磷酸 dATP、 dGTP 、 dCTP、 dTTP； ddNTP: ddATP、 ddGTP、 ddCTP 、 ddTTP； 9 摻入 N個(gè)核苷酸 DNA合成反應(yīng)模式圖 10 DNA單鏈模板 引物 摻入 ddNTP 延伸的新合成鏈 末端終止 11 1. 雙脫氧末端終止法原理 DNA合成反應(yīng)中， ddNTP不存在3′ OH末端 ，故不能與下一個(gè)核苷酸的 5′ 磷酸基團(tuán) 形成 3′ ， 5′ 磷酸二酯鍵，導(dǎo)致 DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP 。 12 ddCTP ddATP ddTTP ddGTP dCTP dATP dTTP dGTP A G C T 5′ T 4 7 11 G A A T G A 3′ A C G C T 13 2. DNA測序主要步驟 14 A反應(yīng)管 G反應(yīng)管 T反應(yīng)管 C反應(yīng)管 15 16 G A T C 17 ● 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ● 單鏈 DNA模板的制備 ● DNA模板與測序引物退火 ● 摻入法標(biāo)記反應(yīng) ● 延伸 終止反應(yīng) ● 放射自顯影 ● 閱讀測序結(jié)果 測序步驟 18 （二） DNA測序自動(dòng)化原理 采用 4種不同的熒光分別標(biāo)記 4種 ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物 ， 替代放射性同位素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn) DNA測序自動(dòng)化的基礎(chǔ) 。 19 ddCTP ddATP ddTTP ddGTP dCTP dATP dTTP dGTP 5′ T G A A T G A 3′ A C G C T 20 21 表示一個(gè) SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)出現(xiàn)了雙峰，對(duì)應(yīng)的核苷酸分別為 C和 T,因此該位點(diǎn)為 CT雜合型，如果該位點(diǎn)只有一個(gè)峰 C或者 T，則該位點(diǎn)基因型為 CC或 TT純合型 22 DNA自動(dòng)測序步驟 4種不同熒光染料標(biāo)記終止物 ddNTPs Sanger測序反應(yīng) 反應(yīng)產(chǎn)物 同一 泳道電泳分離 激光激發(fā)不同大小 DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光 熒光信號(hào)采集、計(jì)算機(jī)分析與 DNA自動(dòng)排序 23 Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 24 與末端終止法不同， 化學(xué)降解法是建立在對(duì)原有 DNA的化學(xué)降解過程基礎(chǔ)上。 （三）化學(xué)降解法 25 將待測 DNA片段 3′ 或 5′ 端進(jìn)行同位素標(biāo)記，標(biāo)記的 DNA片段分成五個(gè)反應(yīng)，分別用不同的化學(xué)試劑處理，造成堿基特異性切割，使 DNA片段分別于某一種（類）堿基處斷裂。電泳分離 5組 DNA混合物，放射自顯影檢測末端標(biāo)記的 DNA鏈的電泳區(qū)帶位置。 化學(xué)降解法 原理 26 化學(xué)降解 G反應(yīng)模式圖 硫酸二甲酯 哌啶 Met Met Met Met 27 最新測序技術(shù) ? 454技術(shù) (Roche ) ? 焦磷酸測序（ Pyrosequencing） ? Solexa測序技術(shù) (Illumina ) ? SOLiD技術(shù) (ABI ) ? 連接法測序 28 舉例： Solexa測序 HiSeq 2023 29 ? Solexa 測序：在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入 4 種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測序（ SBS － sequencing by synthesis ）。 完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖 30 二 、 核酸分子雜交 （ Nucleic Acid Hybridization ） （一） Southern印跡雜交：檢測 DNA (Southern blot hybridization) Southern
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1