基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略教材-文庫(kù)吧在線文庫(kù)
【正文】 單鏈 DNA探針 與待測(cè) RNA形成DNA/RNA雜交雙鏈 ， 加入核酸酶 S1專一性地降解未形成雜交體的 DNA或RNA單鏈 ， DNA/RNA雜交雙鏈則受到保護(hù)而不被降解 。 65 PCR平臺(tái)效應(yīng) 66 （二）耐熱 DNA聚合酶 1. Taq DNA聚合酶（ 實(shí)現(xiàn)了 PCR自動(dòng)化） 從嗜熱水生菌 thermus aquatics YT1株中直接分離出來(lái)。如 GAPDH和 β actin mRNA等。 ③ 分子信標(biāo)探針（ Molecular Beacon Probe） 該探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu) ， 5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán) ， 3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán) 。 12:04:3312:04:3312:041/23/2023 12:04:33 PM 1以我獨(dú)沈久，愧君相見(jiàn)頻。 , January 23, 2023 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒(méi)有。 下午 12時(shí) 4分 33秒 下午 12時(shí) 4分 12:04: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 2023年 1月 下午 12時(shí) 4分 :04January 23, 2023 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 12:04:3312:04:3312:04Monday, January 23, 2023 1知人者智，自知者明。 :04:3312:04:33January 23, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023年 1月 23日星期一 下午 12時(shí) 4分 33秒 12:04: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 107 宏陣列 (Macroarray) 高密度 微陣列( Microarray ) 舉例： HPV診斷芯片 108 DNA微陣列： ● 寡核苷酸微陣列 （ oligomicroarray） ● cDNA微陣列 （ cDNA microarray） 在一微小的基片 （ 硅片等 ） 表面集成了大量分子識(shí)別探針 ， 能夠平行分析大量基因轉(zhuǎn)錄表達(dá) ， 因此又被稱為cDNA芯片 。 93 ② TaqMan Probe 一種水解式熒光標(biāo)記探針 。 DNA復(fù)制引物：?jiǎn)捂?RNA片段 PCR引物： 單鏈 DNA片段 74 PCR引物設(shè)計(jì)原則 ： 或發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNA聚合反應(yīng) (錯(cuò)配 ) 75 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′ 特異擴(kuò)增 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′ 錯(cuò)誤引發(fā) 1. 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ) 2. 引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā) DNA聚合反應(yīng) (錯(cuò)配 ) 76 引物之間應(yīng)避免 3′ 端互補(bǔ) 或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 77 引物自身不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) 78 : ① 引物長(zhǎng)度 : 10～ 30 nt ② 堿基分布 : A、 T、 G、 C 隨機(jī)分布 ③ G+C含量 ： 40 ～ 60% Tm=4(G+C)+2(A+T) ④ 引物 3′ 末端堿基 ：最好選 T、 C、 G，不選 A 避免出現(xiàn) 3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如 GGG或 CCC ⑤ 引物 5′ 末端堿基可不與模板 DNA互補(bǔ) 79 1 A260 oligo DNA≈33μg N: 引物 堿基數(shù) X：合成的 oligo DNA A260單位 Y：引物的 pmol數(shù) 106 Y（ pmol） = X 55 1. PCR循環(huán)由三步組成： ①變性 （ denaturation） ②退火 （ annealing） ③延伸 （ extension） 高溫 合適溫度 合適溫度 56 57 58 2. PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小 : 介于兩條退火引物 5′ 末端之間的 雙鏈 DNA片段 。 α1 α2 αα αα+ α + α+ αα0 α + α0 α 0 α0 41 BamHI BamHI α2 α1 α2 10 kb 14 kb probe ?地中海貧血的直接基因診斷 42 αα/αα αα/α αα/ α / / 正常 缺 1 缺 2 缺 3 缺 4 14kb 10kb 43 （二） Northern印跡雜交 (Northern blot hybridization) 指將 RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定 mRNA分子的含量及其大小。 32 33 印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到 NC等各種膜上，使之成為固相化分子。 7 (一）雙脫氧末端終止法 （ dideoxy chain termination） 8 ATP、 dATP和 ddATP的結(jié)構(gòu) ATP A OH OH H H dATP ddATP NTP: 核苷三磷酸 ATP、 GTP、 C
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