基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略教材-預(yù)覽頁(yè)
【正文】 末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱(chēng)為 “ 探針 ” 。 36 1. 制備基因組 DNA 2. 用限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化基因組 DNA 3. 瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA酶切片段 4. 凝膠預(yù)處理 （如強(qiáng)堿， DNA雙鏈變?yōu)閱捂湥? 5. Southern 印跡轉(zhuǎn)移 6. 標(biāo)記核酸探針、探針與 DNA片段雜交 7. 雜交結(jié)果顯示 Southern印跡雜交基本過(guò)程 37 Southern印跡雜交示意圖 38 將電泳分離的 待測(cè) DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。 44 RNA瓊脂糖凝膠電泳 3kb kb Nt 3638 2604 623 Northern blot hybridization 28S 18S 應(yīng)用舉例 45 GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d Northern blot 雜交分析 mRNA的表達(dá) 靶 mRNA 3磷酸甘油醛脫氫酶 46 三、其他雜交技術(shù) 1. 斑點(diǎn)雜交 (dot blot hybridization） 將 RNA或 DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 53 The replication of DNA 54 原理： PCR是模擬天然 DNA復(fù)制過(guò)程 ， 利用 DNA 聚合酶催化一對(duì)引物間特異 DNA片段合成的體外擴(kuò)增技術(shù) 。 影響因素： ① 引物及 dNTP底物濃度降低。 69 PCR thermal cycler 70 PCR產(chǎn)物的 瓊 脂糖凝膠電泳分析 500bp 400bp 200bp 300bp 1000bp 600bp 700bp 800bp 900bp Marker PCR產(chǎn)物 71 無(wú)機(jī)離子及抑制劑的影響 Taq DNA聚合酶的活性 對(duì) Mg 2+ 濃度和單價(jià)離子（ K+或 NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。 83 RTPCR原理 84 逆轉(zhuǎn)錄酶 ① AMV（ avian myeloblastosis virus） 酶活性最適溫度 42 ℃ ② MMLV（ Moloney murine leukemia virus）：最適溫度 37 ℃ 85 2. 定量 RTPCR（ QRTPCR） 半定量 RTPCR 以樣本 mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，在不同引物對(duì)引導(dǎo)下共同 PCR擴(kuò)增 “看家”基因 和目的基因 cDNA 。 應(yīng)用：用于基因 DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。 94 每產(chǎn)生一條 DNA鏈，就切斷一條探針，每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)， 信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的 DNA分子數(shù)成正比 。 97 ④實(shí)時(shí)熒光定量 PCR計(jì)算原理 PCR擴(kuò)增效率的差異使相同的樣品最終產(chǎn)量有很大差異 98 99 CT或 Tc或 Ct值： 臨界點(diǎn)循環(huán) （ Threshold cycle ） ， 即從基線到指數(shù)增長(zhǎng)的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù) 100 101 ● 傳染病診斷、監(jiān)測(cè)與療效預(yù)后評(píng)估： ● 揭示疾病發(fā)病機(jī)制 102 ⑤ 熒光定量 PCR儀 帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的 PCR儀，配有電腦系統(tǒng)及分析軟件。 113 Western免疫印跡信號(hào)檢測(cè)原理 114 1. 蛋白質(zhì)樣品制備 2. SDSPAGE分離 3. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜 Western blot程序 115 4. 抗體與抗原雜交 5. 信號(hào)檢測(cè)分析 116 謝謝大家！ 靜夜四無(wú)鄰，荒居舊業(yè)貧。 12:04:3312:04:3312:04Monday, January 23, 2023 1乍見(jiàn)翻疑夢(mèng)，相悲各問(wèn)年。 2023年 1月 23日星期一 12時(shí) 4分 33秒 12:04:3323 January 2023 1做前，能夠環(huán)視四周；做時(shí)，你只能或者最好沿著以腳為起點(diǎn)的射線向前。 :04:3312:04Jan2323Jan23 1世間成事，不求其絕對(duì)圓滿(mǎn)，留一份不足，可得無(wú)限完美。 2023年 1月 下午 12時(shí) 4分 :04January 23, 2023 1少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 12:04:3312:04:3312:041/23/2023 12:04:33 PM 1越是沒(méi)有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 :04:3312:04:33January 23, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 下午 12時(shí) 4分 33秒 下午 12時(shí) 4分 12:04: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blanditut cursus. 感謝您的下載觀看 專(zhuān)家告訴
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