【正文】 12:04:3312:04:3312:041/23/2023 12:04:33 PM 1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 12:04:3312:04:3312:04Monday, January 23, 2023 1乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問年。 應(yīng)用：用于基因 DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 53 The replication of DNA 54 原理： PCR是模擬天然 DNA復(fù)制過程 ， 利用 DNA 聚合酶催化一對(duì)引物間特異 DNA片段合成的體外擴(kuò)增技術(shù) 。 完成人類基因組草圖不同測(cè)序儀的比較圖 30 二 、 核酸分子雜交 （ Nucleic Acid Hybridization ） （一） Southern印跡雜交：檢測(cè) DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975 （二） Northern印跡雜交：檢測(cè) RNA (Northern blot hybridization) Stark GR， 1977 31 核酸分子雜交原理 標(biāo)記的 單鏈核酸探針 與待檢測(cè)的靶單鏈 DNA或 RNA局部互補(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈。 應(yīng)用： 核酸靶 DNA或 RNA序列的定性與定量分析。 其主要熱循環(huán)過程為：變性 、退火 、 延伸三個(gè)步驟 。 90 ① 熒光染料 91 92 每形成一個(gè) DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去，染料一結(jié)合就產(chǎn)生熒光信號(hào)， 信號(hào)強(qiáng)度與 DNA分子總數(shù)目成正比 。 :04:3312:04:33January 23, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見青山。 :04:3312:04Jan2323Jan23 1越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 , January 23, 2023 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 :04:3312:04Jan2323Jan23 1故人江海別，幾度隔山川。 ② 半定量標(biāo)準(zhǔn) 計(jì)算 PCR 產(chǎn)物 ： 靶 cDNA /GAPDH cDNA 87 ③ KPNA2在正常生理狀態(tài)東方田鼠和小鼠體內(nèi)表達(dá)分析 88 89 3. 實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR Realtime fluorescent quantitative –PCR，F(xiàn)QPCR PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率改變會(huì)極大地影響產(chǎn)量。 49 4． RNA酶保護(hù)分析法 （ RNase protection assay， RPA） 50 RPA基本程序： ● 待測(cè) RNA的分離 ● 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 RNA探針 ● 待測(cè) RNA與探針 RNA進(jìn)行液相雜交 ● RNA酶消化 ● 不同大小雜交片段凝膠電泳分離 51 三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction, PCR) （一） PCR技術(shù)原理 （二）耐熱 DNA聚合酶 （三） PCR引物及設(shè)計(jì)原則 （四） PCR條件的優(yōu)化 （五） PCR改進(jìn)技術(shù) （六）其它 PCR技術(shù) 52 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) : （一） PCR技術(shù)原理 Mullis K. 1985年發(fā)明的一種模擬天然DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù)。 化學(xué)降解法 原理 26 化學(xué)降解 G反應(yīng)模式圖 硫酸二甲酯 哌啶 Met Met Met Met 27 最新測(cè)序技術(shù) ? 454技術(shù) (Roche ) ? 焦磷酸測(cè)序（ Pyrosequencing） ? Solexa測(cè)序技術(shù) (Illumina ) ? SOLiD技術(shù) (ABI ) ? 連接法測(cè)序 28 舉例： Solexa測(cè)序 HiSeq 2023 29 ? Solexa 測(cè)序：在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)加入 4 種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測(cè)序（ SBS － sequencing by synthesis ）。 32 33 印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到 NC等各種膜上，使之成為固相化分子。 55 1. PCR循環(huán)由三步組成： ①變性 （ denaturation） ②退火 （ annealing） ③延伸 （ extension） 高溫 合適溫度 合適溫度 56 57 58 2. PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小 : 介于兩條退火引物 5′ 末端之間的 雙鏈 DNA片段 。 93 ② TaqMan Probe 一種水解式熒光標(biāo)記探針 。 2023年 1月 23日星期一 下午 12時(shí) 4分 33秒 12:04: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 12:04:3312:04:3312:04Monday, January 23, 2023 1知人者智，自知者明。 下午 12時(shí) 4分 33秒 下午 12時(shí) 4分 12:04: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 12:04:3312:04:3312:041/23/2023 12:04:33 PM 1以我獨(dú)沈久，愧君相見頻。如 GAPDH和 β actin mRNA等。 48 3．核酸