【正文】 三月 2110:57:1310:57Mar2124Mar211越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。 三月 21三月 2110:57:1310:57:13March 24, 20231他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。利用基因捕獲可以建立一個攜帶隨機插入突變的 ES細胞庫 , 每一種 ES細胞克隆中含有不同的突變基因， ES細胞克隆經囊胚注射發(fā)育為基因突變動物模型，通過對動物模型的表型分析鑒定突變基因的功能。 2. 反義寡核苷酸也可引發(fā)基因沉默 由于反義寡核苷酸技術簡便易行，已成為研究基因功能的方法之一。 （一）基因敲除可以使基因的功能完全缺失目 錄基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后會引起胚胎早期死亡，使得無法分析該基因在胚胎發(fā)育晚期和成年期的功能；某些基因在不同的細胞類型中執(zhí)行不同的功能，完全敲除會導致突變小鼠出現復雜的表型，使研究者很難判斷異常的表型是由一種細胞引起的，還是由幾種細胞共同引起的。216。通常采用基因功能獲得和 /或基因功能缺失的策略，觀察基因在細胞或生物個體中的，細胞生物學行為或個體表型遺傳性狀的變化，來鑒定基因的功能。 （二）利用生物網絡研究信號轉導目 錄常用信號通路數據 庫目 錄 代謝網絡處于生物體的功能執(zhí)行階段，其結構組成方式反映了生物體的功能構成。首先收集現有的蛋白質家族，構造模體數據庫；216。 是將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別復雜生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質 蛋白質 /DNA蛋白質 /RNA蛋白質，以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、小分子 蛋白質等的相互作用。216。 被廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和免疫學等領域。 可用于 mRNA的半定量分析 216。開放性系統(tǒng)研究方法 : 如差異顯示 PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物 PCR指紋分析等，可以發(fā)現和分析未知的基因。216。 該方法不需經電泳分離待檢樣品蛋白質，而是預先將樣品包被在支持體上，以后反應過程與 Western 印跡大致相同 ——順序結合（即 “吸附 ”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預先包被抗體， “吸附 ”抗原），再進行酶 底物反應。流式細胞術可以檢測活細胞，也可以檢測用甲醛固定的細胞。目 錄基因芯片的缺點 : 在于它是一個 “封閉系統(tǒng) ”, 它只能檢測人們已知序列的特征 (或有限的變異 )。目 錄 在氨基酸序列整體同源性不明顯的情況下，對蛋白質的功能域進行分析將對預測基因功能提供極其有價值的信息。信號轉導網絡研究的目的是期望通過建立細胞信號傳導過程的模型，找出參與此過程的各個蛋白質間的相互作用關系，闡明其在基因調控、疾病發(fā)生中的作用。216?？烧{控的基因表達系統(tǒng)也是一種常用的方法： 例如四環(huán)素調控系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)可使轉基因動物體內外源基因的表達受誘導劑（四環(huán)素）的調控，通過加入或去除誘導劑，就可以實現對外源基因表達時間及水平的控制。常用的方法主要有基因敲除基因沉默二、采用功能失活策略鑒定基因的功能目 錄 基因敲除（ gene knockout） 屬于基因打靶技術的一種，其操作步驟和原理與基因打靶技術相同。目 錄缺點：1. 該技術可能對靶基因的相似序列發(fā)生作用，導致脫靶（ offtargeting）效應。通過對突變小鼠的深入研究、對突變基因定位及位置候選法克隆突變堿基就會得到突變基因的功能信息。 10:57:1310:57:1310:573/24/2023 10:57:13 AM1以我獨沈久，愧君相見頻。 10:57:13 上午 10:57 上午 10:57:13三月 21楊柳散和風，青山澹吾慮。 三月 21三月 2110:57:1310:57:13March 24, 20231意志堅強的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023/3/24 10:57:1310:57:1324 March 20231做前，能夠環(huán)視四周；做時，你只能或者最好沿著以腳為起點的射線向前。216。目 錄 因此，單單應用 “反向遺傳學 ”不足以完成功能基因組學的任務，而基于 “正向遺傳學 ”的，從異常表型到特定基因突變的 隨機突變篩選策略 逐漸受到青睞。 該現象最早發(fā)現在轉基因植物中，后來這種現象在線蟲、真菌、果蠅、斑馬魚、小鼠早期胚胎中也有發(fā)現。通過基因敲入，可以研究特定基因在體內的功能；也可以與之前基因的功能進行比較；或將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達到靶向基因治療的目的。目 錄　　基因功能獲得策略即通過將目的基因直接導入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因的功能。 （三）利用生物網絡研究代謝途徑目 錄常用代 謝 網 絡 數據 庫目 錄（四）利用生物網絡研究蛋白質相互作用 從某種程度上可以說，細胞進行的生命活動，是蛋白質在一定條件下相互作用的結果，若蛋白質相互作用網絡被破壞或穩(wěn)定性丟失，會引起細胞的功能性障礙。 常用的模體數據庫有 INTERPROSCAN、 PROSITE、SMART等。 原理 : 根據蛋白質分子的兩個屬性 —— 等電點和分子質量 —— 將蛋白質混合物進行分離。 因為快捷、靈敏、信息量大，適合大規(guī)模操作，故稱 “高通量 ”。（三）免疫組化實驗可對組織 /細胞 表達的蛋白質進行原位檢測目 錄216。 RTPCR技術一般用于 RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測 RNA樣品進行半定量分析。 既可分析 mRNA表達又可驗證 cDNA新序列 216。同時也可作為定量分析的補充。目 錄SYBR Green實時定量PCR分析原理示意圖 目 錄二、通過蛋白質檢測揭示基因 翻譯水平的表達特征 Western 印跡（ Western blot） 是一種免疫印跡技術，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯標記物的抗體分子作為探針，檢測轉移到固相支持物上的蛋白質 /多肽分子。免疫組化主要是作為定性、定位的技術，若結合密度計量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數據。 在 RNA水平上，可以對 RNA片段進行掃描、定量與鑒定，對全基因組進行廣譜表達研究。差異表達分析常用的分析方法有 3類：目 錄聚類分析所依據的基本假設： 若組內基因具有相似的表達模式，則它們可能具有相似的功能，例如受共同的轉錄因子調控的基因，或者產物構成同一個蛋白復合體的基因，或者參與相同調控路徑的基因。 基因調控網絡研究就是：利用生物芯片等高通量技術所產生的大量基因表達譜數據，以及蛋白質 DNA間的相互作用等信息，結合實驗室研究結果，用生物信息學方法構建基因調控模型，對某一物種或組織的基因表達關系進行整體性研究，從而推斷基因之間的調控關系，揭示支配基因表達和功能的基本規(guī)律。③ 分子調控網絡建模：即綜合生理病理相關的基因、 SNPs、基因表達狀況，蛋白質功能狀態(tài)以及臨床治療等信息，以系統(tǒng)的方法將不同的測量數據、各種因素的辨識、各個層次上的相互作用關系進行整合，建立數學模型，深入了解疾病過程、揭示復雜疾病的發(fā)病機制。目 錄但轉基因動物模型仍存在一些亟待解決的問題：1. 外源基因插入宿主基因組是隨機的，可能產生插入突變，破壞宿主基因組功能；2. 外源基因在宿主染色體上整合的拷貝數不等；3. 整合的外源基因遺傳丟失而導致轉基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳等。目 錄基因打靶的原理和基本步驟1. 首先 , 從小鼠囊胚分離出未分化的胚胎干細胞 , 然后利用細胞內的染色體 DNA可以與導入細胞的外源 DNA，在相同序列