核酸類(lèi)藥物(已修改)
2025-01-06 06:10 本頁(yè)面
【正文】 第三章 生化藥物制造工藝 （ 核酸類(lèi)藥物 ） 第一節(jié) 核酸類(lèi)物質(zhì)的分離提取及其發(fā)酵生產(chǎn) 一 、 RNA與 DNA的提取與制備 （ 一 ） RNA的提取與制備 工業(yè)用 RNA的提取 （ 1） RNA及其工業(yè)來(lái)源 從微生物中提取 RNA是工業(yè)上最實(shí)際和有效的方法 。 一些最常見(jiàn)的菌體含有豐富的核酸資源 ， 如 酵母 、 白地霉 、 多種抗菌素的 菌絲體 —— 青霉素 ， 制霉菌素等菌體 。 通常在細(xì)菌中 RNA占 5％ ～ 25％ ， 在酵母中占 ％ ～ 15％ ， 在霉菌中占 %～ 28％ 。 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering 在菌體內(nèi) RNA含量的變化受培養(yǎng)基組成影響 ， 其中關(guān)鍵是 銨離子濃度和磷酸鹽濃度 。 培養(yǎng)酵母菌體收率高 ， 易于提取 RNA。 很顯然在許多酵母中 ， 早期細(xì)胞中的 RNA含量高 ，其確切數(shù)值取決于 碳 、 氮比例 和培養(yǎng)基組成等 。 （ 2） 高 RNA含量酵母菌株的篩選 可以從自然界 篩選到 RNA含量高的酵母菌株 ， 也可用 誘變育種 的方法提高酵母菌的 RNA含量 。 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering 稀堿法： 是用 氫氧化鈉溶液 （ 1%） ， 使細(xì)胞壁變性 ， 使 核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái) 。 需用酸中和 PH7。 然后 除去菌體 ， 將 pH調(diào)至 RNA的 等電點(diǎn) （ ） ， 使RNA沉淀 出來(lái) 。 上法的缺點(diǎn)是制得的 RNA Mr較低 ,(磷酸單脂酶 、 磷酸二脂酶降解 RNA， 90 ℃ 保持3~4h破壞酶 )。 濃鹽法： 是用 高濃度鹽溶液 （ 6%~8%） 處理 ， 同時(shí) 加熱 ， 以 改變細(xì)胞壁的通透性 ， 使 核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái) 。 要避免 分子降解 ， 可采用 苯酚法 制備 RNA。 用苯酚處理生物材料 ， 使蛋白質(zhì)變性 ， 然后離心 ， 上層水溶液內(nèi)含有 全部 RNA， 可用 乙醇沉淀 出來(lái) 。 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering 脫氧核糖核蛋白 溶于 濃鹽溶液 1mol/L,不溶于,而 核糖核蛋白 溶于 。 （ 3） RNA的提取實(shí)例： 啤酒酵母是提取 RNA的很好的資源 。 取 100g壓榨啤酒酵母 （ 含水份70%） ， 加入 230ml含 NaOH 3g的水 ， 20℃ 以下緩慢攪拌 30分鐘 。 用 6mol／ L HCl調(diào)至 pH7， 攪拌 15分鐘 ， 離心得清液 255m1。 冷至 10℃ 以下 ， 6mol／ L HCl調(diào) ， 置冷過(guò)夜 ， 離心得 RNA （ 純度 80％ ） 。 （ 二 ） DNA的提取與制備 1． 工業(yè)用 DNA的提取 取新鮮冷凍魚(yú)精 20kg， 用絞肉機(jī)粉碎 2次成漿狀 ，加入等體積水 ， 攪拌均勻 ， 傾入反應(yīng)鍋內(nèi) ， 緩慢攪拌 ，升溫至 100℃ ， 保溫 15分鐘 ， 迅速冷卻至 20～ 25℃ ，離心除去魚(yú)精蛋白等沉淀物 ， 獲得 35L含熱變性 DNA的溶液 ， 經(jīng)精確測(cè)定 DNA含量后直接可用于 酶法降解生產(chǎn)脫氧核苷酸 。 如要制成固體狀 DNA， 在熱變性DNA溶液中逐漸加入等體積 95％ 乙醇 ， 離心可獲得纖維狀 DNA， 沉淀用乙醇 、 丙酮洗滌 ， 減壓低溫干燥得DNA粗品 ， 產(chǎn)品 含熱變性 DNA50％ ～ 60％ 。 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering 具有生物活性 DNA的制備 動(dòng)物內(nèi)臟 （ 肝 、 脾 、 胸腺 ） 加 4倍重量生理鹽水 經(jīng) 組織搗碎機(jī) 搗碎 1分鐘 ， 勻漿于 2500r／ pm離心 30分鐘 ， 沉淀用同樣體積的生理鹽水洗滌 3次 ， 每次洗后離心 ， 將沉淀懸浮于 20倍重量的冷生理鹽水中 ， 再搗碎 3分鐘 ， 加入 2倍量 5％ 的 （ 用 45%乙醇作溶劑 ） 十二烷基磺酸鈉 ， 并攪拌 2～ 3小時(shí) ， 在 0℃ 2500r/min離心 ， 在上層液中加入等體積的 冷 95％ 乙醇 ， 離心即可得到纖維狀 DNA， 再用冷乙醇和丙酮洗滌 ， 減壓低溫干燥得粗品 DNA。 粗品 DNA溶于適量蒸餾水 ， 加入 5％ 十二烷基磺酸鈉 達(dá) 1／ 10體積 ， 攪拌 1小時(shí) ， 經(jīng) 5000rpm離心 1小時(shí) ， 清液中 加入 NaCl達(dá) 1mol／ L， 再緩慢加入 冷 95%乙醇 ， DNA析出 ， 經(jīng)乙醇 、 丙酮洗滌 ， 真空干燥得具有生物活性的 DNA（ 活性 DNA制備需在 0～ 3℃ 操作 ） 。 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering 二 、 用酶解法 、 發(fā)酵法和半合成法制備核苷酸 （ 一 ） 酶解法及堿水解法制備核苷酸 酶解法制備脫氧核苷酸 桔青霉 產(chǎn)生 5’磷酸二脂酶 紅酵母 產(chǎn)生 3’磷酸二脂酶 LINYI UNIVERSITY Department of Pharmaceutical Engineering LINYI UNIVERSITY Department
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