【正文】 急性毒性試驗 急性毒性試驗 (單次給藥毒性試驗 )主要觀察對實驗動物一次給藥后所產生的毒性癥狀及其程度，出現和消失的時間，死亡的發(fā)生率并計算出其最大給藥量，最小致死量、半數致死量 (LD50)等。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現明顯的毒性作用，我國藥政部門把一日內多次給藥觀察受試藥物毒性的實驗也稱作急性毒性實驗。 急性毒性試驗的目的是推測新藥對人的急性毒性的強弱。同時，它可以為長期毒性試驗、生殖毒性試驗、致突變試驗等試驗設計提供劑量選擇依據和有關毒性信息，還可以推測受試藥物毒性發(fā)生的速度和持續(xù)時間，與半數有效量(ED50)比較判斷新藥的安全系數。因此，急性毒性試驗對了解新藥的毒性是非常必要的。 鑒于種種因素造成急性毒性試驗結果 (癥狀和致死量 )在不同實驗室內有較大的差異，且耗費大量動物而所取得的動物毒性的信息量相對較少，因此，各國目前都在修訂急性毒性試驗的技術要求，希望能利用盡可能少的動物數量而取得有價值的信息，同樣達到急性毒性試驗的目的。 第一節(jié) 急性毒性試驗方法的有關問題 一、動物 (一 )動物種 動物種 (或系 )的差異是動物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。為推測新藥對人的急性毒性，某些發(fā)達國家動物急性毒性試驗要求包含非嚙齒類動物 (除家兔外 )在內的兩種動物，我國對此未作出明確規(guī)定。由于中藥已在臨床長期使用，一般認為，如尤特殊情況，使用一種動物已基本上達到急性毒性試驗的目的。目前雖常用的實驗動物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強烈胃腸刺激物，就還應再采用非嚙齒類大動物進行實驗，否則，即使毒性較大 (如巴豆 )也并不能引起大、小鼠嘔吐反應。 (二 )動物的年齡、性別、體重 急性毒性受動物的健康狀態(tài)、年齡、性別、遺傳因素、體重、藥物的吸收、分布、代謝、排泄和內分泌激素等的影響。未成年的動物藥酶活性一般較低，對于經代謝后減毒的藥物表現毒性較強。而且，年幼動物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動物， — 般小鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 1822g(同次試驗體重相差不超過 2g)，大鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 120～ 150g(同次試驗體重相差不超過 10g)。 (三 )動物數量 視不同試驗而異。最小致死量或半數致死量，小動物 (大鼠、小鼠 )試驗組在三組以上，每組 — 般至少 10只動物 (雌雄各半 )。一些國家對動物數和組數不作規(guī)定，因此，有只用 3只一組經多組試驗測得近似致死量或 LD50者。大動物 (犬、猴 )并不 — 定要求得到 LD50，可用少量動物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。最大給約量試驗 — 般要求用小鼠或大鼠 20只即可。 二、試驗準備 實驗應在符合 GLP的實驗室內進行，實驗樣品質量和穩(wěn)定性應符合要求，與藥效學及臨床試驗一致。 (一 )樣品液的配制 中藥材町用濃縮煎劑或浸膏，中藥制劑可用不含輔料的提取物加水或用 o． 5％羧基纖維素鈉， 0． 5％吐溫 — 80， 5％阿拉伯膠等混懸劑、增溶劑配成混懸液等，盡可能配成水溶液，水不溶性成分可用植物汕配成油溶、乳濁液。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗結果，因此，急性毒性試驗報告中應對樣品液的配制方法加以詳細說明，必要時設溶劑對照組。 (二 )樣品液的濃度及給藥容量 為了求得最低致死且或半數致死量，需要設不同劑量組，使部分組反應率在 50％以上，部分組反應率在 50％以下。不同劑量的設定有兩種方式， — 是濃度一定不同給藥容量，另 — 種是容量一定不同給藥濃度，兩者各有所長。 濃度一定適用于某些已經固定濃度的制劑，其有利之處是避免了滲透、粘度、溶質顆粒的分散狀態(tài)等理化性狀不 — 致對毒性試驗結果的影響，因此，濃度一定也可得到較好的結果，但由于動物的投藥用量是有限的，范圍較窄，按體重給藥容量難以達到試驗要求。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應勺體液濃度等滲 (至少不應低滲 )，口服液不必作特殊考慮，對毒性低的中藥制劑而言，應以能保持一定流動性的最大濃度作為口服樣品液。 三、給藥方法 (一 )動物禁食 動物購入后應在實驗室觀察 1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴張，小鼠和大鼠至少應停食 4 6h，要求一夜停食 (不停水 )，投藥后再停食 34h。 (二 )給藥途徑 中藥新藥除臨床給藥途徑外， — 、二類新藥還希望其他給藥途徑，水溶性藥 物應同時采用靜脈給藥途徑，其他如油劑，混懸劑之類可采用皮下給藥途徑。腹腔汁射在人體極少用，中藥粗制劑成分復雜，動物毒性試驗中也盡可能少用，以避免腹腔刺激性的干擾。 各給藥途徑的容量一般為小鼠 0． 4— 0． 5ml／ 20g(體重 )，大鼠 lml／l00g(體重 )。小鼠口服最大容量不超過 0． 8ml／ 20g(體重 )，其他途徑不超過0． 5ml／ 20g(體重 )。大鼠口服最大容量不超過 2ml／ l00g(體重 )，其他途徑不超過 lml／ l00g(體重 )。 四、急毒試驗觀察指標和致死量的計算 (一 )觀察指標 不能把求得致死劑量看作是急性毒性實驗的唯一要求。發(fā)現毒性癥狀及毒性反應的靶器官同樣是急毒實驗非常重要的目的。給藥前后應觀察體重、進食、進水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。以后 1日至少觀察 1次，觀察 7 日觀察癥狀包括①行動：不安定、多動、發(fā)聲；②神經系統(tǒng)反應：舉尾、振顫、痙攣、運動失調、姿態(tài)異常；③自主神經系統(tǒng)反應：眼球突出、流涎、流汨、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸；④死亡。應每日記錄體重、毒性反應和死亡情況，瀕死動物應單獨飼養(yǎng)，死后及時解削進行肉眼觀察和病理組織學觀察。試驗結束存活動物也進行解剖，如有病變進行組織學觀察。 (二 }致死劑量計算 可用 Bliss點斜法、簡化機率法、改進寇氏序貫法等計算最小致死量或半數致死量。Bliss法嚴謹精確，缺點是計算非常繁復。但近代有計算機軟件，汁算方法可推薦Bliss法。各種方法原則基本相同，如：①劑量劉數值應為等差，即劑量應按等比級數排列；②各組動物數應相等；③死亡率應在 50％上下基本對稱分布等。但各種方法還各有特殊設計要求，如有的要求 Dm和 Dn必須為 100％和 0％死亡率等，可參考有關專著，此處不贅述。如受試物毒性低，測不出 LD50，可求得最大給藥量。 第二節(jié) 急性毒性試驗方法 一、 LD50的測定 最小致死量是使動物剛好致死的藥物劑量，但由于藥物的性質，給藥方法和個體差異，每只動物的最小致死量確很大的差異，實驗和統(tǒng)訓學原理表明一群動物最小致死量的平均值相當于半數致死量。半數致死量測定方法很多，但實驗沒計大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗方法如下： 預試驗：目的是找出 0％及 100％估計致死量。更確田地說是找到 — 個 0死亡的最大劑量和 100％死亡的最小劑量的估值以決定實驗中采用的最大劑量 (Dm)和最小劑量 (Dn)，這在測定中非常重要，是實驗成敗的關鍵。可用雌或雄性動物，設四組以上，每組 34只，先用 1； 10的劑量比給藥 (如 5mg／ kg、50mg／ kg、 500mg／ kg、 5000mg／ kg固定劑量 )。觀察 7日，記錄死亡動物數。然后在死亡數 4／ 4和 0／ 4兩組之間按 1； 2(如 50mg/kg、 100mg/kg、 200mg／kg、 400mg／ kg)以下的劑量比進行重復試驗，以此測得近似的 0和 100％死亡率。 正式試驗：在預試驗 Dn和 Dm劑量范圍內按等比設三個以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在 1； 0． 6至 1： 0． 9范圍內。購入動物試驗前應馴化 1星期，隨機或按體重分組，每組 10只以上，雌雄各半，分別編號，給藥前應禁食 (不禁水 )過夜。各給藥組和溶劑對照組按體重給藥后，試驗當日應多次觀察，第二日至最后 — 日應每日有二人以上同時觀察 1次并及時詳細汜錄毒性反應癥狀，癥狀出現和消失的時間，死亡時間，第七日全部動物測量體重處死并剖檢，肉眼觀察病