【正文】 三、實驗方法 將受試物滴入或涂敷于 — 側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，劑量為 0． 1ml或 0． 1g，另 —惻作賦形劑對照。必要時應(yīng)進行病理組織學(xué)檢查。粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形刑時，也應(yīng)參考臨床使用方法，合理配制。 結(jié)果報告時要注明光照條件，包括：裝置概要、光源種類、制造廠家、亮度或強度、光照距離等。一般用白色豚鼠， 500g以下 (即 1～ 3個月齡 )，雌雄各半，雌性動物應(yīng)是來受孕過的功物。④致敏結(jié)束 1星期后，在背部或側(cè)腹預(yù)先脫毛處，包封式徐敷受試物(0． 1ml或 0． 1g)24h激發(fā)。①步驟② — ③每日重復(fù) 1次，連續(xù) 3次。以上是代表性步驟。 三、受試物 受試物如為膏劑或液體劑型，可直接涂抹于去毛皮膚；如是固體粉末或中藥散劑，需加適量水或其他賦形劑 (如羊毛脂、凡士林、橄欖等 )混合均勻，以保證受試物與皮膚接觸良好。原發(fā)反應(yīng)在 1— 2日內(nèi)達到最劇，消退較快，多次給藥的皮膚刺激實驗，每日涂抹 1次，連續(xù) 1星期或以上。 二、受試物 應(yīng)盡量與臨床用制劑 — 致。 毒性很小的中藥外用制劑，也可用全身給藥途徑 (如皮下注射等 )反應(yīng)具毒性。如急毒試驗濃度超過臨床用量 20倍 (經(jīng)劑量轉(zhuǎn)換 )而未出現(xiàn)毒性反應(yīng)或死亡，叫只設(shè)一個相當臨床用量 20倍以上的劑量組和一個對照組。 第二節(jié) 皮膚黏膜用藥長期毒性試驗 皮膚黏膜用藥急性毒性試驗?zāi)康氖?，觀察動物皮膚 (完整皮膚和破損皮膚 )或黏膜反復(fù)多次接觸受試物，因吸收作用而使機體產(chǎn)生的毒性反應(yīng)。 有些毒性很小的外用制劑，也可用全身給藥途徑 (如皮下注射等 )反應(yīng)其毒性。動物宜采用大鼠或豚鼠。破損皮膚的制作采用不同方法將去毛消毒皮膚劃破 (消毒手術(shù)刀作井字劃破或砂紙磨擦打毛 )，以滲血為度。如果是局部用藥治療全身疾患的，還應(yīng)參照全身用藥的規(guī)定做長期毒性試驗。考慮到中藥的特點，可根據(jù)急毒實驗發(fā)現(xiàn)有病變的器官組織和中藥藥性可能出現(xiàn)中毒的靶器官、靶組織具體確定。對給藥期間死亡動物、瀕臨死亡和計劃活殺動物都應(yīng)進行病理組織學(xué)檢杳。 (6)總蛋白 (TP)：用以求出球蛋白含量。 3 血液生化 血液生化檢測反應(yīng)動物體內(nèi)各系統(tǒng)、各組織器官的功能狀態(tài)或受損情況。攝食量 (g)／體重增加 (g)是說明體重變化原因的重要指標。給藥周期：嚙齒類一般不超過 6個月，非嚙齒類不超過9個月。 (2)如采用臨床試驗用制劑，對照組應(yīng)給等容量的賦形劑，應(yīng)注意有時賦形劑或溶劑的種類和用量會影響藥物的實驗結(jié)果。摻飼給藥 (摻入飼料或飲水中給藥 )應(yīng)有保證攝入規(guī)定藥量的措施，還應(yīng)有均勻混合、穩(wěn)定性及質(zhì)量檢杳等措施。靜脈注射或肌內(nèi)注射給藥可以肌內(nèi)注射或皮下注射。飲水要潔凈，防止病源微生物、重金屬或其他有毒物質(zhì)的污染。有條件者應(yīng)盡可能選用清潔級、 SPF級試驗設(shè)施。對照組動物數(shù)，可以與給藥組相同，也可按公式計算：對照組動物數(shù)：給藥組動物數(shù) x劑量組數(shù)的平方根。嚙齒類中，大鼠公認為首選動物，其次是小鼠、地鼠或豚鼠等；非嚙齒類中，常用的是犬，也可根據(jù)需要選用猴、貓、兔或小型豬等。 長期毒性實驗 本書的長期毒性實驗與國際現(xiàn)行的反復(fù)給藥的毒性實驗概念是基本一致的，包含了過去“亞急性毒性實驗”、“亞慢性毒性實驗”、“慢性毒性實驗”及“終身毒性實驗”等稱謂。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動物在 15— 33C下，體溫波動在 1. 5C以內(nèi)。 試驗周期 3個月之內(nèi)的，嚙齒類宜用 6— 8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類可用 6— 10月齡的犬，每組數(shù)量 6只；試驗周期 3個月以上的，嚙齒類宜用 6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至 3040只。 但是，鑒于人體與各種動物對各類化合物的吸收、分布、代謝、排泄以及各類型毒性反應(yīng)的差異，尚無規(guī)律可循，現(xiàn)有化學(xué)藥品統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在進行臨床研究時，仍應(yīng)根據(jù)實驗結(jié)果參考文獻資料報道進行由低到高的安全治療劑量的探索。劑量累積法則適用大動物，利用大約 6只合格動物即可進行急性毒性試驗的全面觀察。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)計算，該劑量不可能大于 LD14。有毒性反應(yīng)、體重減輕或臟器有病變的動物應(yīng)在剖檢后立即進行主要臟器的病理組織學(xué)觀察。半數(shù)致死量測定方法很多，但實驗沒計大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗方法如下： 預(yù)試驗：目的是找出 0％及 100％估計致死量。試驗結(jié)束存活動物也進行解剖，如有病變進行組織學(xué)觀察。 各給藥途徑的容量一般為小鼠 0． 4— 0． 5ml／ 20g(體重 )，大鼠 lml／l00g(體重 )。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗結(jié)果，因此，急性毒性試驗報告中應(yīng)對樣品液的配制方法加以詳細說明，必要時設(shè)溶劑對照組。而且，年幼動物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動物， — 般小鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 1822g(同次試驗體重相差不超過 2g)，大鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 120～ 150g(同次試驗體重相差不超過 10g)。 鑒于種種因素造成急性毒性試驗結(jié)果 (癥狀和致死量 )在不同實驗室內(nèi)有較大的差異，且耗費大量動物而所取得的動物毒性的信息量相對較少，因此，各國目前都在修訂急性毒性試驗的技術(shù)要求，希望能利用盡可能少的動物數(shù)量而取得有價值的信息，同樣達到急性毒性試驗的目的。 急性毒性試驗的目的是推測新藥對人的急性毒性的強弱。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強烈胃腸刺激物，就還應(yīng)再采用非嚙齒類大動物進行實驗，否則，即使毒性較大 (如巴豆 )也并不能引起大、小鼠嘔吐反應(yīng)。最大給約量試驗 — 般要求用小鼠或大鼠 20只即可。 三、給藥方法 (一 )動物禁食 動物購入后應(yīng)在實驗室觀察 1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴張，小鼠和大鼠至少應(yīng)停食 4 6h，要求一夜停食 (不停水 )，投藥后再停食 34h。給藥前后應(yīng)觀察體重、進食、進水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。但各種方法還各有特殊設(shè)計要求，如有的要求 Dm和 Dn必須為 100％和 0％死亡率等，可參考有關(guān)專著，此處不贅述。 正式試驗：在預(yù)試驗 Dn和 Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在 1； 0． 6至 1： 0． 9范圍內(nèi)。試驗選用擬推薦臨床試驗的給藥途徑，以動物能耐受的最大濃度 (溶液仍有較好的流動性 )，最大體積的給藥量 1次或 1日內(nèi) 2～ 3次給予動物。有的采用劑量遞增法即 — 只動物一個劑量以幾何級數(shù)遞增，根據(jù)前個劑量的反應(yīng)，決定下 — 個劑量。 (二 )安全性評價 (1)根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果判斷供試藥物毒性的強弱、類型。 三、動物規(guī)格和數(shù)量 長期毒性實驗一般由雌雄各半、健康無病、檢疫合格的動物組成。大鼠、小鼠應(yīng)為 12h明， 12h暗；倉鼠應(yīng)是 14h明， l0h暗。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實驗動物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性實驗結(jié)果。 第一節(jié) 實驗動物 一、動物種類 (1)我國對中藥三、四類新藥，處方中各味藥材均符合法定標準，無毒性藥材，無十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理 (水、乙醇粗提者除外 )，難以測出 LD50，而給藥量大于 20g(生藥 )／ kg(體重 )，臨床用藥期為 1星期以內(nèi)者可免做長期毒性實驗。由于不同國家、不同實驗室的動物經(jīng)過長期傳代，其品系基因已發(fā)生了很大的變化，因此長期毒性實驗動物必須來源清楚，并有繁殖生產(chǎn)合格證號。 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對動物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會影響動物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對比。各劑量組和對照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。 二、給藥途徑和方法 給藥途徑應(yīng)盡量與臨床一致。 灌胃容積，大鼠一般每 100g體重 1— 2ml，小鼠為 0． 10. 3ml／ l0g(體重 )。高劑量組應(yīng)有少數(shù)動物出現(xiàn)嚴重毒性反應(yīng)或死亡 (不超過 20％ )，低劑量組應(yīng)相當或略高于藥效學(xué)試驗的有效劑而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，中劑量組在高低劑量組之可以等比關(guān)系排列。中藥藥理毒理研究的技術(shù)要求 ≥中規(guī)定：中藥三、四類新藥，