【正文】 為變化。 第三節(jié) 觀察指標(biāo) 一、檢測(cè)次數(shù) 試驗(yàn)周期在 3個(gè)月以內(nèi)的，末次給藥后 24h，每組活殺部分動(dòng)物 (1／ 2— 2／ 3)，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，余下動(dòng)物停藥繼續(xù)觀察 2— 4星期之后，同樣活殺全面檢測(cè)，以了解可能出現(xiàn)的遲緩性毒忭和毒性反應(yīng)的可逆程度。中藥藥理毒理研究的技術(shù)要求 ≥中規(guī)定：中藥三、四類(lèi)新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)毒性藥材，無(wú)十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理(水、乙醇粗提除外 )，難以測(cè)出 LD50而給藥量大于 20g生藥／ kg(體重 )，臨床用藥期為 1早期以內(nèi)者町免做長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。如采用不含賦形劑制劑，對(duì)照組可給等容量的水等溶劑。高劑量組應(yīng)有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反應(yīng)或死亡 (不超過(guò) 20％ )，低劑量組應(yīng)相當(dāng)或略高于藥效學(xué)試驗(yàn)的有效劑而不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，中劑量組在高低劑量組之可以等比關(guān)系排列。對(duì)中藥復(fù)方制劑很難做到這點(diǎn)，必須摻飼，給藥時(shí)，采用現(xiàn)喂現(xiàn)摻的方法較好。 灌胃容積，大鼠一般每 100g體重 1— 2ml，小鼠為 0． 10. 3ml／ l0g(體重 )。腹腔注射時(shí)大部分藥物依然是首先入肝，因此不能完全代替臨床注射給藥途徑。 二、給藥途徑和方法 給藥途徑應(yīng)盡量與臨床一致。 第二節(jié) 受試藥物 一、藥物形式 應(yīng)與臨床試驗(yàn)用制劑完全 — 致 (除可以不含賦形劑外 )。各劑量組和對(duì)照組的飼養(yǎng)條件應(yīng)等同。 (4)溫、濕度適中且穩(wěn)定：常溫動(dòng)物在 15— 33C下，體溫波動(dòng)在 1. 5C以內(nèi)。 (2)光照規(guī)律：因生物節(jié)律對(duì)動(dòng)物的反應(yīng)性有明顯的影響，光照會(huì)影響動(dòng)物的生物節(jié)律從而影響不同批次之間的毒性對(duì)比。 試驗(yàn)周期 3個(gè)月之內(nèi)的，嚙齒類(lèi)宜用 6— 8周齡的大鼠，每組數(shù)量不少于20只；非嚙齒類(lèi)可用 6— 10月齡的犬，每組數(shù)量 6只；試驗(yàn)周期 3個(gè)月以上的，嚙齒類(lèi)宜用 6周齡的大鼠，每組數(shù)量應(yīng)增至 3040只。由于不同國(guó)家、不同實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期傳代，其品系基因已發(fā)生了很大的變化，因此長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須來(lái)源清楚，并有繁殖生產(chǎn)合格證號(hào)。 二、動(dòng)物品系 實(shí)驗(yàn)應(yīng)選用封閉群動(dòng)物，如嚙齒類(lèi)的 Wistar或 Sprague Dewley品系大鼠，非嚙齒類(lèi)的 Beagle犬。 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 一、動(dòng)物種類(lèi) (1)我國(guó)對(duì)中藥三、四類(lèi)新藥，處方中各味藥材均符合法定標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)毒性藥材，無(wú)十八反、十九畏等配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理 (水、乙醇粗提者除外 )，難以測(cè)出 LD50，而給藥量大于 20g(生藥 )／ kg(體重 )，臨床用藥期為 1星期以內(nèi)者可免做長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)。 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)的主要目的有： — 是觀察藥物在選定時(shí)間內(nèi)反復(fù)給予動(dòng)物的情況下，動(dòng)物出現(xiàn)損害的靶組織或器官及劑量 — 效應(yīng)關(guān)系和可逆性等；二是了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)藥物能耐受的劑量范圍和對(duì)人來(lái)說(shuō)可能無(wú)毒的安全劑量。室內(nèi)飼養(yǎng)另種動(dòng)物，或其他飼養(yǎng)條件的突然改變，均可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，從而影響毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。濕度是種潛熱，宜控制在 30％ — 70％。大鼠、小鼠應(yīng)為 12h明， 12h暗；倉(cāng)鼠應(yīng)是 14h明， l0h暗。非嚙齒類(lèi)可用 46月齡的犬，每組數(shù)量 6只。 三、動(dòng)物規(guī)格和數(shù)量 長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)一般由雌雄各半、健康無(wú)病、檢疫合格的動(dòng)物組成。 (3)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)推測(cè)長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)劑量具重要意義，、不同種動(dòng)物之間的差異，急性毒性結(jié)果無(wú)論用體重劑量還是體表面積劑量計(jì)算常見(jiàn)有差異而尚無(wú)規(guī)律。 (二 )安全性評(píng)價(jià) (1)根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果判斷供試藥物毒性的強(qiáng)弱、類(lèi)型。另外，國(guó)外還有采用固定劑量給藥觀察近似致死劑量，以決定藥物毒性大小者。有的采用劑量遞增法即 — 只動(dòng)物一個(gè)劑量以幾何級(jí)數(shù)遞增，根據(jù)前個(gè)劑量的反應(yīng)，決定下 — 個(gè)劑量。如用 10只動(dòng)物未見(jiàn)毒性反應(yīng)或死亡則該劑量不可能大于 LD26。試驗(yàn)選用擬推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑，以動(dòng)物能耐受的最大濃度 (溶液仍有較好的流動(dòng)性 )，最大體積的給藥量 1次或 1日內(nèi) 2～ 3次給予動(dòng)物。 LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用 Bliss法，改進(jìn)寇氏法、點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化概率單位法或其他的計(jì)算方法。 正式試驗(yàn)：在預(yù)試驗(yàn) Dn和 Dm劑量范圍內(nèi)按等比設(shè)三個(gè)以上劑量組，其組間劑量的比值，一般在 1； 0． 6至 1： 0． 9范圍內(nèi)。更確田地說(shuō)是找到 — 個(gè) 0死亡的最大劑量和 100％死亡的最小劑量的估值以決定實(shí)驗(yàn)中采用的最大劑量 (Dm)和最小劑量 (Dn)，這在測(cè)定中非常重要，是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。但各種方法還各有特殊設(shè)計(jì)要求，如有的要求 Dm和 Dn必須為 100％和 0％死亡率等，可參考有關(guān)專著，此處不贅述。 (二 }致死劑量計(jì)算 可用 Bliss點(diǎn)斜法、簡(jiǎn)化機(jī)率法、改進(jìn)寇氏序貫法等計(jì)算最小致死量或半數(shù)致死量。給藥前后應(yīng)觀察體重、進(jìn)食、進(jìn)水的狀況，密切觀察異常毒性癥狀，特別是給藥后的一、二日。小鼠口服最大容量不超過(guò) 0． 8ml／ 20g(體重 )，其他途徑不超過(guò)0． 5ml／ 20g(體重 )。 三、給藥方法 (一 )動(dòng)物禁食 動(dòng)物購(gòu)入后應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室觀察 1星期，口服給藥前，為減少吸收差異和大容量給藥造成胃急性擴(kuò)張，小鼠和大鼠至少應(yīng)停食 4 6h，要求一夜停食 (不停水 )，投藥后再停食 34h。 (二 )樣品液的濃度及給藥容量 為了求得最低致死且或半數(shù)致死量，需要設(shè)不同劑量組，使部分組反應(yīng)率在 50％以上，部分組反應(yīng)率在 50％以下。最大給約量試驗(yàn) — 般要求用小鼠或大鼠 20只即可。 (三 )動(dòng)物數(shù)量 視不同試驗(yàn)而異。但在某些特殊情況下，例如受試物中已知含有強(qiáng)烈胃腸刺激物，就還應(yīng)再采用非嚙齒類(lèi)大動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則，即使毒性較大 (如巴豆 )也并不能引起大、小鼠嘔吐反應(yīng)。 第一節(jié) 急性毒性試驗(yàn)方法的有關(guān)問(wèn)題 一、動(dòng)物 (一 )動(dòng)物種 動(dòng)物種 (或系 )的差異是動(dòng)物急性毒性差異的主要原因，藥酶則是毒性種差的重要原因之一。 急性毒性試驗(yàn)的目的是推測(cè)新藥對(duì)人的急性毒性的強(qiáng)弱。由于中藥毒性常較小，單次給藥往往不能表現(xiàn)明顯的毒性作用，我國(guó)藥政部門(mén)把一日內(nèi)多次給藥觀察受試藥物毒性的實(shí)驗(yàn)也稱作急性毒性實(shí)驗(yàn)。 鑒于種種因素造成急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 (癥狀和致死量 )在不同實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有較大的差異，且耗費(fèi)大量動(dòng)物而所取得的動(dòng)物毒性的信息量相對(duì)較少，因此，各國(guó)目前都在修訂急性毒性試驗(yàn)的技術(shù)要求，希望能利用盡可能少的動(dòng)物數(shù)量而取得有價(jià)值的信息，同樣達(dá)到急性毒性試驗(yàn)的目的。目前雖常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是小鼠或大鼠。而且，年幼動(dòng)物藥物代謝功能和敏感度較易發(fā)生變化，性別間的特性也尚未確立，因此，口服毒性通常使用年輕的性成熟的動(dòng)物， — 般小鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 1822g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò) 2g)，大鼠 6— 8周齡，兩種性別，體重 120～ 150g(同次試驗(yàn)體重相差不超過(guò) 10g)。大動(dòng)物 (犬、猴 )并不 — 定要求得到 LD50，可用少量動(dòng)物采用劑量遞增的方法觀察中毒癥狀，求近似致死量即可。也有用乙醇、聚乙醇等溶劑配成樣品液者，但溶劑本身的急性毒性能干擾試驗(yàn)結(jié)果，因此，急性毒性試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對(duì)樣品液的配制方法加以詳細(xì)說(shuō)明，必要時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。因此，通常采用同容量不同濃度的給藥方法，注射給藥藥液濃度應(yīng)勺體液濃度等滲 (至少不應(yīng)低滲 )，口服液不必作特殊考慮，對(duì)毒性低的中藥制劑而言，應(yīng)以能保持一定流動(dòng)性的最大濃度作為口服樣品液。 各給藥途徑的容量一般為小鼠 0． 4— 0． 5ml／ 20g(體重 )，大鼠 lml／l00g(體重 )。發(fā)現(xiàn)毒性癥狀及毒性反應(yīng)的靶器官同樣是急毒實(shí)驗(yàn)非常重要的目的。試驗(yàn)結(jié)束存活動(dòng)物也進(jìn)行解剖，如有病變進(jìn)行組織學(xué)觀察。各種方法原則基本相同，如：①劑量劉數(shù)值應(yīng)為等差，即劑量應(yīng)按等比級(jí)數(shù)排列；②各組動(dòng)物數(shù)應(yīng)相等；③死亡率應(yīng)在 50％上下基本對(duì)稱分布等。半數(shù)致死量測(cè)定方法很多，但實(shí)驗(yàn)沒(méi)計(jì)大同小異，所不同者為算方法的不同，其試驗(yàn)方法如下： 預(yù)試驗(yàn)：目的是找出 0％及 100％估計(jì)致死量。然后在死亡數(shù) 4／ 4和 0／ 4兩組之間按 1； 2(如 50mg/kg、 100mg/kg、 200mg／