【正文】 微生物技術(shù)應(yīng)用微生物技術(shù)與應(yīng)用核心知識第1章緒論微生物技術(shù)的概念：所有直接或間接的利用微生物、微生物的機能、微生物的組成部分或其代謝產(chǎn)物（如酶）來加工生產(chǎn)產(chǎn)品，或為社會提供服務(wù)的技術(shù)。微生物技術(shù)的特點：需要多學(xué)科的指示，既多學(xué)科性質(zhì)。微生物技術(shù)發(fā)展趨向：v微生物基因組研究形成巨大推動力v新微生物類群的發(fā)現(xiàn)將拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域v生物質(zhì)資源導(dǎo)向性新經(jīng)濟體制的建立v可持續(xù)發(fā)展的重要基石 微生物技術(shù)的基本原理：具有基礎(chǔ)性作用來講，主要是以下三學(xué)科的相關(guān)原理：微生物學(xué)與分子生物學(xué)、發(fā)酵工藝學(xué)、生化分離理論微生物應(yīng)用的基本技術(shù)可以分為以下幾類：微生物分離與純培養(yǎng)技術(shù)、菌種選育技術(shù)、培養(yǎng)基制備技術(shù)、滅菌技術(shù)、大規(guī)模發(fā)酵與控制技術(shù)、產(chǎn)物分離與純化技術(shù)微生物技術(shù)的流程一般可以分為三個部分：菌種分離與選育部分；發(fā)酵培養(yǎng)部分；產(chǎn)物分離純化部分。第2章 微生物資源開發(fā)與菌株選育第一節(jié) 常用微生物的類群一、工業(yè)化菌種應(yīng)符合下述要求：q能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產(chǎn)物q有關(guān)合成產(chǎn)物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造的可操作性要強q遺傳性能要相對穩(wěn)定q不易感染它種微生物或噬菌體q產(chǎn)生菌及其產(chǎn)物的毒性必須考慮（在分類學(xué)上最好與致病菌無關(guān)）q生產(chǎn)特性要符合工藝要求二、工業(yè)上重要細菌：埃希氏大腸菌、醋酸桿菌、假單胞菌、短桿菌、棒狀桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈孢囊菌屬、芽孢梭菌、鏈球菌三、放線菌1概念：放線菌（Actinomyces）是指在形態(tài)上具有分枝狀菌絲、菌落形態(tài)與霉菌相似，以孢子進行繁殖的原核微生物。放線菌實際上是屬于細菌范疇內(nèi)的原核微生物，只不過其細胞形態(tài)為分枝狀菌絲。2放線菌對人類最突出的貢獻：就是它能產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗生素有近6000種，其中4000多種是由放線菌產(chǎn)生的（其中90%由鏈霉菌產(chǎn)生）。3工業(yè)上重要放線菌屬：鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬、小單胞菌屬、鏈孢囊菌屬四、真核微生物凡是細胞核具有核膜、能進行有絲分裂、細胞質(zhì)中存在線粒體或同時存在葉綠體等細胞器的微小生物，都稱為真核微生物。1真菌：具有細胞壁，不含葉綠素，無根莖葉的分化，以產(chǎn)生大量孢子進行繁殖，以寄生或腐生方式生存的真核微生物。2工業(yè)上重要真菌：酵母菌、霉菌、蕈菌五、極端微生物極端微生物（extremophiles），也叫極端環(huán)境微生物，是最適合生活在極端環(huán)境中的微生物的總稱，包括嗜熱、嗜冷、嗜酸、嗜堿、嗜壓、嗜鹽、抗輻射、耐干燥和極端厭氧等多種類型嗜熱菌的最著名的產(chǎn)品：Taq酶第二節(jié) 菌株的分離與篩選一、新種分離與篩選的一般步驟：1定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性，設(shè)計合理的篩選方案。2采樣：有針對性地采集樣品。3增殖（富集）：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。4分離：利用分離技術(shù)得到純種。5生產(chǎn)性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。二、樣品采集：采樣對象——土壤、水、空氣、枯枝爛葉、植物病株、爛水果等都含有眾多微生物，但總體來講土壤樣品的含菌量最多。 采樣季節(jié)——以溫度適中，雨量不多的秋初為好。采土方式——在選好適當?shù)攸c后，除去表土，取離地面515cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。三、增殖（富集）：富集的目的：讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使篩選變得可能。富集培養(yǎng)的方法：1控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分：不同種類的微生物，對營養(yǎng)的成分的需求不同，在培養(yǎng)基中添加要分離的目的菌容易利用而其他雜菌不易利用的成分，目的菌因得到充足的營養(yǎng)而迅速繁殖，其他微生物則由于不能利用這些物質(zhì)，生長受到抑制。2 控制培養(yǎng)條件：在篩選某些微生物時，除通過培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇外，還可通過它們對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達到有效的分離目的。如細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿（～），霉菌和酵母菌要求偏酸（～6）。因此，富集培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到被分離微生物的要求范圍不僅有利于自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。分離放線菌時，可將樣品液在40℃恒溫預(yù)處理20分鐘，有利于孢子的萌發(fā)，可以較大的增加放線菌數(shù)目，達到富集的目的。3抑制不需要的菌類：通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達到富集的目的。從土壤中分離芽孢桿菌時，由于芽孢具有耐高溫特性，100℃很難殺死，要在121℃才能徹底死亡?？上葘⑼翗蛹訜岬?0℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進行分離。在富集培養(yǎng)基中加入適量的膽鹽和十二烷基磺酸鈉可抑制革蘭陽性菌的生長，對革蘭陰性無抑制作用。篩選霉菌時，可在培養(yǎng)基中加入四環(huán)素等抗生素抑制細菌，使霉菌在樣品的比例提高，從中便于分離到所需的菌株。分離放線菌時，在樣品懸浮液中加入10滴10%的酚或加青霉素（抑制G+菌）、鏈霉素（抑制G菌）各30～50U/ml，以及丙酸鈉10μg/ml（抑制霉菌類）抑制霉菌和細菌的生長。四、分離方法分離是指采用一定的方法，將采集的含菌樣品分散接種到分離培養(yǎng)基上，以獲得單個的菌落。1． 常用的分離方法：水懸浮稀釋法、干土噴射法、孢子飛揚法。2．水懸浮稀釋法：又稱濕法分離，是最常用的一種分離土壤微生物的方法。具體方法是：取風干并破碎的土樣1g，加如無菌水10mL，劇烈震搖1min，然后靜置1min，使粗砂粒沉淀，吸取上面的懸浮液1mL，用無菌水進行系列梯度稀釋，涂布于分離平板上培養(yǎng)。干土噴射法：又稱干法分離。該法是用一種特制的噴土器將研碎的干土樣直接噴射到分離平板上，根據(jù)土樣的多少、噴射距離的遠近以及噴射角度來調(diào)節(jié)每個平板的噴射量。孢子飛揚法：是將土樣置于一種瓶口剛好能倒扣一個分離平版的特制瓶中，距離振蕩使孢子飛揚，撞在分離平板上，進行分離培養(yǎng)。該法可分離到許多放線菌。某些細菌的富集條件五、生產(chǎn)性能測定確認獲得純的單一菌落后，進行代謝產(chǎn)物的篩選（如產(chǎn)酶、抗生素等），將分離到的符合篩選目標的菌株保藏、鑒定。高通量篩選與自動化：高通量篩選技術(shù)（High throughput screening，HTS），是將各種模型固定在微孔板（96孔甚至384孔），進行自動稀釋、加樣，并用機器人讀結(jié)果，用計算機記錄、計算、整理分析實驗結(jié)果，使篩選從繁重的勞動中解放出來，實現(xiàn)了篩選的快速、準確、微量、重現(xiàn)性高和大規(guī)?；８咄亢Y選技術(shù)的關(guān)鍵是建立一種微量、靈敏、可自動化操控的篩選模型。以熱穩(wěn)定蛋白酶產(chǎn)生菌篩選為例：將選出的菌落接液體試管進行微量培養(yǎng)，以對硝基苯胺短肽衍生物為反應(yīng)底物，在96孔板中65℃下反應(yīng)10min和40min，分別用微孔讀板儀測定酶活，然后用兩種酶活的比值作圖來代表酶的熱穩(wěn)定性，選出熱穩(wěn)定性高的菌株。第三節(jié) 菌種改良一、菌種改良的方法：自然選育、誘變育種、雜交育種和基因工程育種。（一）自然選育：在生產(chǎn)過程中，未經(jīng)人工誘變或雜交處理，利用菌種的自發(fā)突變，從而選育出優(yōu)良菌種的過程，叫做自然選育。一般習慣上將自然選育稱為菌種的分離純化。自然狀態(tài)下，堿基對發(fā)生自然突變的機率僅為108～109，出現(xiàn)優(yōu)良性狀的可能較小，需堅持相當長的時間才能收到效果。（二）誘變育種：誘變育種是指用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的突變菌株的一種育種方法。 誘變育種與其他育種方法相比，具有操作簡便、突變率高、突變譜廣的優(yōu)點，它不僅能提高產(chǎn)量，改進質(zhì)量，還可擴大產(chǎn)品品種和簡化工藝條件，至今仍是一種重要的、廣泛應(yīng)用的微生物育種方法。誘變育種的不足是缺乏定向性。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑。物理誘變劑中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。 大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣誘變劑物理誘變劑：紫外線、X射線、γ射線，快中子等化學(xué)誘變劑烷化劑：EMS、DES、NTG堿基類似物：5溴尿嘧啶其他誘變劑：亞硝酸、羥胺生物誘變劑：轉(zhuǎn)座因子（三）誘變育種的一般步驟：誘變育種包括出發(fā)菌種選擇、誘變處理和篩選突變株三個部分。出發(fā)菌株應(yīng)具備：① 對誘變劑的敏感性高；② ②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力。要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。出發(fā)菌株開始時可以同時選2～3株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 （1）誘變劑的選擇：在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。 （2）誘變處理方式單一因子處理復(fù)合因子處理：兩種以上因素先后使用、同時使用或單一因子重復(fù)使用 菌種經(jīng)誘變處理后，會產(chǎn)生各種各樣的突變類型，需要選擇一定的篩選方式，將具有所需性狀的突變株篩選出來。實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩的目的：確認符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。突變株的常用篩選方法：A菌體形態(tài)變異分析：有些菌體的形態(tài)變異與產(chǎn)量的變異存在著一定的相關(guān)性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當多的突變菌株并不存在這種相關(guān)性，但是在篩選工作中應(yīng)盡可能捕捉、利用這些直接的形態(tài)特征性變化。當然，這種鑒別方法只能用于初篩。B平皿快速檢測法：是利用菌體在特定固體培養(yǎng)基平板上的生理生化反應(yīng)，將肉眼觀察不到的產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化成可見的“形態(tài)”變化。具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等。一般只能定性或半定量用，常只用于初篩，可以大大提高篩選的效率。C搖瓶培養(yǎng)法：是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，然后，再對培養(yǎng)液進行分析測定。搖瓶與發(fā)酵罐的條件較為接近，所測得的數(shù)據(jù)就更有實際意義。但是搖瓶培養(yǎng)法需要較多的勞力、設(shè)備和時間，所以，搖瓶培養(yǎng)法常用于復(fù)篩。特殊變異菌株的篩選方法：特殊變異菌株，如營養(yǎng)缺陷型、抗性突變菌株、溫度敏感突變株、組成型突變株等。營養(yǎng)缺陷型或抗性突變等的性狀就象一個高效分離的“篩子”，以它們?yōu)楹Y選的條件，可以大大加快篩選的進程并有效地防止漏篩。在現(xiàn)代的育種中，常有意以它們作為遺傳標記選擇親本或在DNA中設(shè)置含這些遺傳標記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預(yù)見性。（四）雜交育種：不同基因型的品系或種屬間，通過交配或體細胞融合等手段形成雜種，或者是通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)形成重組體，再從這些雜種或