【正文】 免疫新技術(shù)在科研中的應(yīng)用 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 高豐光 抗原或抗體的檢測(cè) ? 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) ? 抗原抗體反應(yīng)的影響因素 ? 常用的抗原抗體反應(yīng) 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) ? 高度的特異性 ? 可逆性 ? 抗原抗體結(jié)合除了空間構(gòu)象互補(bǔ)外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等分子表面的化學(xué)基團(tuán)之間的非共價(jià)方式結(jié)合。這種非共價(jià)鍵不如共價(jià)鍵結(jié)合穩(wěn)定，極易受溫度、酸堿度和離子強(qiáng)度的影響而解離。 ? 抗原抗體比例影響免疫復(fù)合物的大小 ? 抗原抗體反應(yīng)的兩個(gè)階段 抗原抗體反應(yīng)的影響因素 ? 抗原抗體濃度與比例 ? 電解質(zhì) ? 抗原抗體特異性結(jié)合后，親水性降低，易受電解質(zhì)的影響而使表面失去較多的負(fù)電荷。 ? 溫度 ? 適當(dāng)?shù)臏囟瓤稍黾涌乖c抗體分子的碰撞機(jī)會(huì)，加速抗原抗體復(fù)合物的形成。 ? 酸堿度 ? 抗原抗體反應(yīng)的最適 pH在 6— 8之間， pH過高或過低，即過堿或過酸，均可影響抗原、抗體的理化性質(zhì)。 常用的抗原抗體反應(yīng) ? 凝集反應(yīng) ? 沉淀反應(yīng) ? 免疫標(biāo)記技術(shù) 凝集反應(yīng) ? 直接凝集反應(yīng) ? 血型鑒定 ? 肥大反應(yīng) ? 間接凝集反應(yīng) ? 間接凝集抑制試驗(yàn) ? 微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) 間接凝集反應(yīng) ? 將可溶性抗原或抗體吸附在與免疫無關(guān)的顆粒載體上，形成致敏顆粒，再與相應(yīng)抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生的凝集反應(yīng)，稱為間接凝集反應(yīng)。 ? 顆粒載體有紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠顆粒、活性炭顆粒，而相應(yīng)的凝集現(xiàn)象分別稱為間接血球凝集、間接乳膠凝集、間接炭粒凝集反應(yīng)。 微粒捕獲酶免疫分析技術(shù) ? 將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素 — 親和素 — 酶放大系統(tǒng)相結(jié)合，最后酶作用于熒光底物，使之發(fā)熒光，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)抗原的含量。 ? 檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物 CAl9 CEA、 CAl2AFP、性激素、甲狀腺素 TT+、葉酸、HIV抗體、 HCG等微量可溶性抗原。 沉淀反應(yīng) ? 速率散射比濁法／免疫比濁法 ? 瓊脂擴(kuò)散法 ? 單向瓊脂擴(kuò)散 ? 雙向瓊脂擴(kuò)散 ? 火箭電泳 ? 對(duì)流免疫電泳 ? 免疫印跡技術(shù) 速率散射比濁法／免疫比濁法 ? 將已知抗體與相應(yīng)抗原在液相中按一定比例混合形成可溶性免疫復(fù)合物，這些復(fù)合物微小粒子對(duì)一定波長(zhǎng)的光照射發(fā)生散射，可通過三個(gè)光路系統(tǒng)測(cè)定光散射(OD值 )。 ? 抗體含量固定并處于抗體過剩時(shí)，免疫復(fù)合物的多少直接取決于抗原的濃度，抗原的終濃度通過標(biāo)準(zhǔn)品繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出。 ? 提高了靈敏度，通過自動(dòng)化，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品并進(jìn)行精確的定量分析。 ? 檢測(cè)前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、尿微量蛋白及 IgG、 IgM、 IgA及補(bǔ)體，藥物含量分析。 免疫印跡技術(shù) ? 將用 SDS— 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGE分離得到的按分子量大小排列的非標(biāo)記蛋白轉(zhuǎn)移到固相載體膜上，再用標(biāo)記的特異性的抗血清或單克隆抗體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析的技術(shù)，其鑒定蛋白質(zhì)的敏感性為 1— 5ng。 ? 檢測(cè)可溶性抗原、細(xì)胞成分的鑒定與分析，檢測(cè)與自身變性細(xì)胞核成分結(jié)合的抗體 (抗核抗體 )， HIV的明確診斷。 免疫印跡法的基本步驟 ? 電泳分離蛋白抗原， SDS是一種陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，十二烷基磺酸根帶負(fù)電荷，使樣品中各種蛋白質(zhì)與 SDS形成 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于蛋白質(zhì)表面均帶有相同密度的負(fù)電荷，使分子構(gòu)型幾乎相同 (線性 )。因此 SDSPAGE中， SDS多肽復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子質(zhì)量有關(guān)，而不受所帶電荷及分子形態(tài)的影響。 ? 將 SDSPAGE分離到的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至固相的硝酸纖維素膜上。 ? 蛋白條帶可用酶、同位素標(biāo)記的一抗或二抗進(jìn)行特異性反應(yīng)，加入顯色底物或放射自顯影以顯示結(jié)果。 免疫標(biāo)記技術(shù) ?免疫酶測(cè)定法 ?免疫熒光技術(shù) ?放射免疫測(cè)定法 ?免疫膠體金技術(shù) 免疫酶測(cè)定法 ? 是一種用酶標(biāo)記一抗或二抗檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法。 ? 將抗原 — 抗體反應(yīng)的高度特異性與酶對(duì)底物的高效催化作用有效地結(jié)合起來，通過酶分解底物產(chǎn)生有色物質(zhì) (也可作用于熒光底物，產(chǎn)生熒光 )，肉眼觀察顏色深淺或酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值 (OD)，以反映抗原或抗體的含量。 ? 本法靈敏度高，檢測(cè)可溶性抗原或抗體、組織或細(xì)胞表面特異性抗原。 ELISA ? 雙抗體夾心法 (sandwich assay) ? 檢測(cè)血清、腦脊液、胸、腹水等各種液相中的可溶性抗原 ? 間接法 ? 測(cè)定細(xì)胞及組織表面抗原 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn) (enzyme—linked immunospot assay， ELISPOT) ? 用已知細(xì)胞因子的抗體包被固相載體 ， 加入待檢效應(yīng)細(xì)胞 ， 溫育一定時(shí)間后洗去細(xì)胞 ， 如待檢效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)細(xì)胞因子 ， 則與已包被的抗體結(jié)合 ， 再加入酶標(biāo)記抗該細(xì)胞因子抗體 ， 加底物顯色 。 ? 一般選擇硝酸纖維素膜 (NC)或聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜覆蓋微量反應(yīng)板作為固相 ， 在分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞所在局部呈現(xiàn)有色斑點(diǎn) ， 一個(gè)斑點(diǎn)表示一個(gè)分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的細(xì)胞 ， 通過計(jì)數(shù)可推算出分泌某種細(xì)胞因子細(xì)胞的頻率 。 免疫熒光技術(shù) ? 用熒光素標(biāo)記一抗或二抗，檢測(cè)特異性抗原或抗體的方法。 ? 常用 的熒光素有異硫氰酸熒光素(nuorescein isothiocyanate， FITC)、藻紅蛋白 (phycoerythrin， PE)等。在激發(fā)光的作用下，可直接發(fā)射熒光，前者發(fā)黃綠色熒光，后者發(fā)紅色熒光。 Immunofluorescent stain of immunoglobulin G (IgG) showing linear pattern in Goodpasture39。s syndrome 天皰瘡免疫熒光染色 放射免疫測(cè)定法 ? 用放射性同位素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行的免疫測(cè)定。 ? 既有同位素的敏感性又有抗原抗體結(jié)合的特異性，同時(shí)具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn)。 ? 廣泛應(yīng)用于激素、藥物等微量物質(zhì)的檢測(cè)。 免疫膠體金技術(shù) ? 氯金酸 (HAuCl+)在還原劑作用下，產(chǎn)生分散狀態(tài)的膠體金顆粒。堿性條件下，金顆粒表面帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)正電荷基團(tuán)結(jié)合。 ? 膠體金可標(biāo)記白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。大分子以單層形式吸附在金顆粒表面。 ? 不同還原劑作用于氯金酸，產(chǎn)生的膠體金粒徑大小不相同 (5—50nm)，小粒徑的膠體金由于穿透性好，電子密度高，常被用于免疫電鏡技術(shù)。這些小粒徑的金顆粒，經(jīng)銀顯影液處理后，金粒子還原銀離子生成銀顆粒而吸附在金顆粒周圍呈黑褐色，從而放大了金顆粒的顯色效果，又稱免疫金銀法。 ? 膠體金顏色隨顆粒大小而變化，大于 20 nm的金顆粒在光鏡下呈現(xiàn)磚紅色，可在光鏡水平行免疫分析，也可用銀顯影劑增強(qiáng)，進(jìn)一步提高靈敏度。 ? 當(dāng)膠體金的粒徑較大、濃度密集時(shí)肉眼水平即可觀察，即膠體金斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)和膠體金斑點(diǎn)免疫層析試驗(yàn)。 免疫細(xì)胞的檢測(cè) ? 免疫細(xì)胞的