【正文】 優(yōu)秀畢業(yè)設計1 引言1. 1牛血清白蛋白的簡介 蛋白質是一類重要的生物大分子，它在生物體內占有特別重要的地位，蛋白質和核酸是構成細胞內原生質的主要成分，而原生質是生命現(xiàn)象的基礎。蛋白質的結構決定了蛋白質的性質和功能，相對于其他蛋白質而言，血清白蛋白的結構并不復雜，血清白蛋白(Serum Albumin)是人和哺乳動物體內血漿中含量最豐富的蛋白質，約占血漿總蛋白的60%。它是血液緩沖劑，能維持正常的血液滲透壓:并且它還可以存儲和轉運眾多的內源性和外源性物質。血清白蛋白是一種重要的蛋白質，在血液中的平均濃度為42g/L()有著極其重要的生理功能。另一方面，相對而言，血清白蛋白比較容易分離提純，可以大量制備。所以，血清白蛋白成為研究蛋白質的理化性質、生物學功能、體內代謝、臨床應用和遺傳變異等方面的理想蛋白質，從五十年代開始人們對其展開了大量的研究，以期在分子水平上揭示相關生命過程的奧秘。牛血清是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成份，具有極為重要的功能。，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。2. 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調變它們所結合的物質活力。，起到解毒作用。、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。在動物血液中,白蛋白分子和其他血液成分共同協(xié)調保護紅細胞,處于等滲狀態(tài),此外,白蛋白分子能運輸代謝產物,保持動物生理狀態(tài)。牛血清白蛋白產品(BSA) 是一種用途廣泛的生物產品，能配制細胞培養(yǎng)基；配制標準蛋白質試劑盒；借用電泳技術測定未知蛋白質的分子量。BSA產品是血清的稀釋劑,是其它蛋白質的穩(wěn)定劑。配在酶試劑中,BSA 可以保護酶的活性,而不讓酶短期失活。用在免疫生化的Elisa 和免疫雜交工作中,BSA 能做非專一性吸附雜質的抑制劑,BSA 產品能聯(lián)結抗體抗原、受體蛋白,做親和吸附劑中的手臂(arm) [1]。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，簡寫為BSA)是由582個氨基酸殘基組成，分子量約為67000，. BSA支鏈中含有17個對維系蛋白質空間結構穩(wěn)定性起重要作用的二硫鍵，由它們組成八對結構交叉相鄰的二硫橋鍵按物理特性溶解度來分，牛血清白蛋白屬于清蛋白，溶于水、稀鹽、稀酸及稀堿溶液，能為飽和硫酸按所沉淀。按其生物功能分，其屬于轉運蛋白。按其形狀和大小分，其屬于球狀蛋白，形狀接近于球型或橢球形，疏水的氨基側鏈位于分子內，親水的側鏈在外面暴露于水溶劑，因此在水中的溶解性非常好。因為蛋白質是兩性高分子電解質，主要由疏水性各不相同的20種氨基酸組成。在水溶液中，多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內部折疊的趨勢，使親水性氨基酸殘基分布在蛋白質立體結構的外表面。即使如此，一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面，形成疏水區(qū)。疏水性氨基酸含量高的蛋白質的疏水區(qū)大，疏水性強。因此，蛋白質表面由不均勻分布的荷電基團形成的荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構成[2]。 幾種分離方法的比較 利用基因工程菌發(fā)酵生產蛋白質，料液中含有大量組成復雜的培養(yǎng)基、菌體代謝產物等，目標蛋白的含量常常不到蛋白質總量的1%。新近發(fā)展的親和色譜具有很高的選擇性，但吸附過程的少量雜質非特異性結合使純化效果大大降低，且能和酶專一結合的配基選擇困難。毛細管凝膠電泳也只能分離微量的蛋白質純品，需要高壓電場，無法放大。大多數(shù)蛋白質是生物活性物質，溶液的pH值、離子強度的變化都可能使其變性失活，特別是被用作醫(yī)藥、結構研究的蛋白質，不僅要有一定的純度，產品的活性保持也很重要。反膠團法分離蛋白質，使蛋白質始終處于有水的環(huán)境中，不致失活，有機相可循環(huán)使用，設備簡單、料液預處理簡單，不存在膜污染，對于蛋白質分離方法的改進具有重要意義。生物產品的生產費用50－90％耗費在分離純化過程中，因此，對這一過程的研究和改進具有重要意義。目前，所采用的生化產品分離方法主要有鹽析、沉淀、層析、電泳、高效液相色譜等，它們的共同缺點是連續(xù)操作和放大困難。沉淀(precipitation)是物理環(huán)境的變化引起溶質的溶解度降低生成固體凝聚物(aggregates)的現(xiàn)象，利用沉淀原理分離蛋白質等生物產物的回收、濃縮和純化。水溶液中蛋白質的溶解度一般在生理離子強度范圍內()最大，而低于或高于此范圍時溶解度均降低，蛋白質在高離子強度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為鹽析(Saltingout)，利用鹽析沉淀初級純化的產物中鹽含量較高，一般在鹽析沉淀后，需進行脫鹽處理。層析是根據(jù)混合物中,溶質在互不混溶的兩相之間分配行為的差別,料液處理量小。離子交換層析的變量多,。影響分離特性的因素復雜,難放大。而疏水性相互作用層析應用普遍。電泳(electrophoresis)是荷電溶質(溶解質)在電場作用下發(fā)生定向泳動的現(xiàn)象。電泳分離是利用荷電溶質在電場中泳動速度的差別進行分離的方法。電泳法主要分區(qū)帶電泳、等電點電泳和等速電泳等。這些電泳法又根據(jù)是否使用凝膠載體分為凝膠電泳和自由流電泳。自由流電泳適用于連續(xù)分離操作，但分離效果易受對流和擴散的影響，凝膠電泳較自由流電泳的分離度高，但凝膠載體對溶質泳動產生的阻力影響電泳速度，并且耗電量大，處理量小[2]。高效液相色譜法在抗生素中應用廣泛，但分析要求高效柱和高靈敏檢測、高速、微量避免生物樣品的變質，所以對實驗儀器要求嚴格，容易受試驗條件限制，同時成本高產量卻不高。 反膠團體系 新近發(fā)展起來的反膠團體系使在溫和條件下大規(guī)模分離生物分子成為可能。反膠團萃取技術具有高選擇性、易放大、萃取相(反膠團相)可循環(huán)利用以及分離和濃縮同步進行等優(yōu)點，特別適用于蛋白質的分離[3]，既利用了溶劑萃取的優(yōu)點，又實現(xiàn)了生物物質的有效分離，作為一種新型的生物分離技術應用于蛋白質、氨基酸及藥物、農藥等物質的分離分析中，顯示了巨大的應用潛力。反膠團萃取技術的發(fā)現(xiàn)，是分離技術研究領域的一項突破。該技術應用過程中，較少使用毒性試劑，對人體無害，而且反膠團溶液可反復利用，親和配體的引入，還可提高目標物的萃取率及分離的選擇性[4]。反膠團是當油相中表面活性劑的濃度超過臨界膠束濃度后，其分子在非極性溶劑中自發(fā)形成的親水基向內、疏水基向外的具有極性內核(polar core)的多分子聚集體[4]。反膠團體系由表面活性劑、助溶劑、水和有機溶劑構成。反膠團體系具有如下特征：熱力學穩(wěn)定；自發(fā)形成；表面張力低（小于10－）；透明（反膠團的直徑小于100nm）；比表面大。黏度同普通有機溶劑相仿。反膠團的表面活性劑分子層能夠避免蛋白質分子與有機溶劑接觸，從而保持蛋白質的活性。反膠團法利用蛋白質等生物物質在水相和反膠團相間分配的不同進行萃取分離。形成反膠團的基本推動力來源于表面活性劑分子的疏水尾之間的疏水相互作用以及親水頭基間的靜電和氫鍵等作用力[5]。用作形成反膠團溶液的有機溶劑主要有：正辛烷、異辛烷、環(huán)己烷、苯、甲苯、氯仿等[6]。離子型雙親物質在非極性溶劑中不能電離，只能以離子對形式存在，形成反膠團的基本推動力來源于表面活性劑分子的疏水尾之間的疏水相互作用以及親水頭基間的靜電和氫鍵等作用力。由于這些作用力在非極性溶劑的環(huán)境中較弱，反膠團形成的推動力小得多，所以形成的反膠團的聚集數(shù)也很小，一般在10以下，而且隨著表面活性劑濃度的變化而變化，但是，在很寬的濃度范圍內聚集數(shù)并無突變，不存在明顯的臨界膠束濃度，水或其他極性雜質的存在可以大大增加聚集