【正文】 臨床常見細菌的手工鑒定和結果判斷一．細菌的鑒定步驟鑒定的概念：將一個未知的菌株按其生物學特性，經過與所有已知菌種進行比較后劃歸到一個已知菌種的分析過程。對待鑒定的菌種要明確已經獲得純化培養(yǎng)或者該菌種在血平板上生長良好，有單個菌落可以進行生化試驗。（我們這里一般都是預先純化培養(yǎng)）對待鑒定的菌種進行革蘭染色，觀察形態(tài)（G+c，G–b，G–c，G+b），做觸酶，氧化酶實驗，然后按科，屬，種逐步鑒定。要注意對待鑒定的菌種選擇一個合適的鑒定系統(tǒng)，臨床常見細菌的快速簡單的鑒定系統(tǒng)我們都已經設計好，參考鑒定質控單。按鑒定質控單的要求填寫好病人姓名，年齡，性別；標本類型，標本編號，送檢日期等。另外最重要的是要填寫好該菌種的菌落形態(tài)以及有無溶血。復習革蘭染色，觸酶實驗，氧化酶實驗。⑴．革蘭染色：是細菌鑒定過程中最常用最基本最重要的染色方法。首先要將待鑒定的細菌涂片，固定（目的：殺死細菌，改變細菌對染料的通透性）。第一步：以結晶紫初染（染色液Ⅰ）第二步：以盧戈氏碘液媒染（染色液Ⅱ）第三步：用95%乙醇脫色（染色液Ⅲ）第四步：最后用稀釋復紅復染（染色液Ⅳ）⑵．觸酶實驗(H2O2實驗)：：具有過氧化氫酶的細菌能催化雙氧水生成水和初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現氣泡。：一般用玻片法，就是挑取菌落在潔凈的玻片上涂開，滴加3%過氧化氫數滴，觀察結果（立即有大量氣泡產生者為陽性，不產生氣泡者為陰性）。要注意不能在血平板上進行實驗，這樣易出現假陽性；另外陳舊菌落要是進行實驗可能會導致假陰性結果；還有不能在接種針或環(huán)上進行實驗。，陰性對照用鏈球菌；試劑要避光置4℃冰箱保存。：絕大多數含細胞色素的需氧和兼性厭氧細菌觸酶實驗陽性，鏈球菌屬陰性。臨床常見細菌鑒定實驗中我們一般用于區(qū)別葡萄球菌屬（+），微球菌屬（+），鏈球菌屬（－）。⑶．氧化酶實驗（Kovac實驗）：a.原理：氧化酶又稱細胞色素酶，是細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。酶并不直接與試劑（1%鹽酸四甲基對苯二胺）起反應，而是首先使細胞色素c氧化，然后氧化型細胞色素c使對苯二胺氧化，出現深蘭色反應。b.方法（濾紙法，菌落法，試劑紙片法）：一般我們采用濾紙法，取白色潔凈濾紙條，沾取菌落少許，加試劑一滴，陽性者立即呈粉紅色，繼而出現深蘭色。結果讀取在10秒鐘時為最佳，60秒內讀取可靠。本實驗避免接觸含鐵物質（假陽性），也不能在含糖培養(yǎng)基上生長的菌落進行實驗（假陰性）。c.陽性對照用銅綠假單胞菌，陰性對照用大腸埃希菌。d.應用：奈瑟氏屬的菌種均陽性，也用于區(qū)別假單胞菌屬和腸桿菌，前者陽性，后者陰性。 二．葡萄球菌屬的鑒定 葡萄球菌屬主要的種有金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。形態(tài)與染色：～，菌體圓形，呈單個，成雙以及不規(guī)簇狀排列。染色呈紫色，為革蘭陽性球菌。2．與鏈球菌的區(qū)別：觸酶實驗為陽性，而鏈球菌陰性；菌體形態(tài)鏈球菌小于葡萄球菌，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形的革蘭陽性球菌。3. 與微球菌的區(qū)別：觸酶實驗同為陽性，但微球菌的菌體呈四聯(lián)狀，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化發(fā)酵實驗（操作方法同甘露醇OF試驗）為氧化型；而葡萄球菌為發(fā)酵型。另外呋喃唑酮（即痢特靈50μg/片）敏感實驗微球菌為耐藥，而金黃色葡萄球菌為敏感。4．葡萄球菌屬的種間鑒定：⑴．菌落色素與溶血毒素：金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃色，檸檬色或者淡黃色，而其他葡萄球菌則在血平板上菌落大多數為白色，也有部分為檸檬色或深黃色。⑵．溶血毒素：金黃色葡萄球菌有α﹑β﹑γ﹑δ溶血毒素，各毒素的區(qū)別是對動物紅細胞的溶血范圍﹑抗原性及溶血時的溫度等。其中以α溶血毒素為主。而其他葡萄球菌大多數不產生溶血毒素，只有表葡有極少能產生溶血毒素。⑶．血漿凝固酶實驗：用與區(qū)別金黃色葡萄球菌（陽性），表皮葡萄球菌（陰性），腐生葡萄球菌（陰性）。血漿凝固酶是金葡菌所產生的，有結合凝固酶和游離凝固酶兩種。血漿凝固酶檢測有兩種方法，為玻片法和試管法，我們一般采用玻片法。a. 操作方法：挑取少許金黃色葡萄球菌菌落在玻片上與血漿乳化，結合凝固酶能作用于血漿中的纖維蛋白原，從而在金黃色葡萄球菌表面發(fā)生凝集，所以我們肉眼能看見凝集顆粒。玻片法主要由結合凝固酶作用產生；游離凝固酶是金黃色葡萄球菌產生的胞外酶，能與血漿中的血漿凝固反應因子（類似凝血酶的一種物質）作用，形成復合物再使纖維蛋白原轉化成纖維蛋白而發(fā)生凝集。試管法主要由游離凝固酶作用產生。b. 注意事項：菌落不能太多，否則會影響結果觀察；凝固酶陽性要做自凝陰性對照（用生理鹽水代替血漿），只有在陰性對照也不凝集才能認為是真正的陽性，有一部分葡萄球菌有自凝現象。⑷．新生霉素敏感實驗：金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌對新生霉素紙片（5μg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌則對之耐藥。抑菌環(huán)直徑16mm即為新生霉素敏感。⑸．甘露醇氧化發(fā)酵實驗：：取兩支甘露醇微量生化管，在微量管內接種待檢細菌，然后一支加兩滴石臘密封，另外一支則不加，放37℃孵箱內18～24h后觀察結果。：微量生化管變黃色為陽性，也就是能利用甘露醇。若兩管都變黃色則說明是發(fā)酵型；其中加石蠟管不變色，沒加石蠟管變黃色則為氧化型；如果兩管都不變色則說明該細菌是不利用甘露醇（產堿型）。：金黃色葡萄球菌在需氧和厭氧的條件下都能利用甘露醇（即兩管都變黃色）；表皮葡萄球菌需氧部分產酸，厭氧條件下不利用甘露醇（即沒加石蠟管有部分會變黃色，加石蠟管不變黃色）；腐生葡萄球菌與表皮葡萄球菌類似。 三．微球菌屬的種間鑒定微球菌屬主要的種有易變微球菌，藤黃微球菌，玫瑰微球菌。鑒定生化見下表 微球菌屬的種間鑒定易變微球菌 藤黃微球菌 玫瑰微球菌 色素產生 黃色 黃色 粉紅色需氧葡萄糖產酸 ＋ ＋ －硝酸鹽還原 ＋ － －脲素酶 d d ＋氧化酶 － ＋ －/＋（弱）新生霉素敏感 S/R S R d：不定 S：敏感 R：耐藥 四．鏈球菌屬1． 形態(tài)和染色：～，呈成雙和鏈狀排列的卵圓形革蘭陽性球菌，菌體小于葡萄球菌，無鞭毛，沒有芽胞，但有些菌株會形成莢膜。肺炎鏈球菌呈矛頭狀，寬端相對，尖端向外。2． 根據鏈球菌在血平板上溶血現象的不同分為三種：⑴甲型（α）溶血，即菌落周圍出現較窄的草綠色溶血環(huán)；⑵乙型（β）溶血，即菌落周圍出現較寬的透明溶血環(huán)；⑶丙型（γ）溶血，即菌落周圍無溶血環(huán)。3． 根據抗原結構（C多糖抗原）的不同可分為A﹑B﹑C﹑D﹑E﹑F﹑G﹑H﹑K﹑L﹑M﹑N﹑O﹑P﹑Q﹑R﹑S﹑T等18個群，對人類有致病者90%屬于A群，偶見其他群鏈球菌致病。4． 鏈球菌屬的種間鑒定⑴．乙型溶血鏈球菌的鑒定：a． 對桿菌肽（）（抑菌圈直徑≥10mm）敏感：A群鏈球菌（主要為化膿性鏈球菌）。b． 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，但馬尿酸鈉水解實驗﹑CAMP實驗陽性：B群鏈球菌（主要為無乳鏈球菌）。c． 對桿菌肽不敏感，膽汁七葉苷實驗陰性，馬尿酸鈉水解實驗陰性，CAMP實驗陰性：主要為馬鏈球菌﹑類馬鏈球菌﹑獸疫鏈球菌；對三者的區(qū)別實驗要加做海藻糖和山梨醇實驗。d． CAMP實驗：將能產生β溶血的金黃色葡萄球菌在血平板上劃一橫線接種，再將待鑒定菌于金黃色葡萄球菌3mm處垂直種一短線，若在有CO2條件下培養(yǎng)5～6小時，或無CO2條件下培養(yǎng)18～24小時，在兩細菌連接處出現一個半月型的加強溶血區(qū)即為CAMP實驗陽性。⑵．甲型溶血鏈球菌的鑒定：a． 草綠色鏈球菌：對桿菌肽敏感，對奧普托欣（Optochin）不敏感，膽汁溶菌實驗陰性，膽汁七葉苷實驗陰性，在高鹽中不生長。主要有變異鏈球菌，輕型鏈球菌，血鏈球菌，唾液鏈球菌等。