【正文】 ****畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）紫外誘變對(duì)Lovastatin產(chǎn)量的影響畢業(yè)論文目錄 5 5 6 6 6 6 7 7 7 超聲波復(fù)合誘變 7 8 8 8 9 pH值 9 10 10 10 洛伐他汀含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展 11 11 12 13 13 13 HPLC 法測(cè)定洛伐他汀的含量 14 14 14 15 15 17 18 18 18 18 18 實(shí)驗(yàn)方法 18 18 18 19 19 19 19 19 19 20 21 21 21. terreus UV1503的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 22 23 23 23 25致謝 26參考文獻(xiàn)： 27附：英文文獻(xiàn)翻譯 30洛伐他汀的分子式為C24H36O5，分子量404。熔點(diǎn)157℃159℃，易溶于甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯、氯仿及苯中，不溶于正己烷及石油醚中。在甲醇中紫外光譜顯示的最大值在2223246nm，在70％乙醇中的最大紫外吸收波長在236nm，在KBr溶液中的紅外線光譜吸收波長為355,2970,1696,1220nm[1]。 洛伐他汀的分子結(jié)構(gòu)式眾所周知，心腦血管疾病已成為全球人類死亡的主要原因。在歐美等發(fā)達(dá)國家，該病的死亡率居各種疾病之首，占死亡總?cè)藬?shù)的 40 %～50 %。在我國，其死亡率僅次于惡性腫瘤，居第二位。缺血性心腦血管病的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)。其病理核心是膽固醇在動(dòng)脈壁的沉著，幾乎所有的脂蛋白均涉及此過程，諸如極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、中間密度脂蛋白膽固醇( IDL)以及三酰甘油( TG) 等。凡血漿中VLDL、IDL、LDL及載脂蛋白B(apoB) 濃度高于正常值為高脂蛋白血癥，易導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化，高密度脂蛋白膽固醇( HDL)、載脂蛋白A(apoA) 濃度低于正常，也成為動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因子[2,3]。他汀類藥物在心腦血管疾病治療方面的應(yīng)用是一次革命性的里程碑。因?yàn)樗勺钄嗄懝檀己铣傻年P(guān)鍵步驟，從而使調(diào)脂藥獲得突破性進(jìn)展。從近幾年世界藥品市場(chǎng)來看，降血脂藥物中發(fā)展得較快的品種首推HMG CoA 還原酶抑制劑。 洛伐他汀是1979年由遠(yuǎn)騰報(bào)道從紅色紅曲霉中分離得到的，稱為Monacolin K。1980 年Alberts等從土曲霉發(fā)酵液分離得到一個(gè)降血漿膽固醇物質(zhì)，即洛伐他汀。隨后人們又發(fā)現(xiàn)與其結(jié)構(gòu)相似的Monacolin J、L、X、M、Dihydromevinolin 及Dihyfromonacolin L等成分[4]。目前，生產(chǎn)洛伐他汀所采用的微生物主要有三大類: 青霉菌、紅曲霉和土曲霉，由于這些菌株的代謝途徑多樣性，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)種的不同菌株產(chǎn)洛伐他汀的能力差別很大，多數(shù)菌株往往不能合成洛伐他汀。在幾種生產(chǎn)洛伐他汀的微生物中，土曲霉是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的菌種。如上所述，洛伐他汀是可以顯著降低血膽固醇的物質(zhì)，能降低活體內(nèi)低密度脂蛋白(LDL)的含量，同時(shí)提高高密度脂蛋白( HDL)的含量，從而有效降低血漿中膽固醇含量。研究還證明，洛伐他汀在人體內(nèi)含量只要達(dá)到 ～，膽固醇的合成就會(huì)受阻，經(jīng)弱堿加工形成的鹽類具有防治膽結(jié)石、前列腺肥大、降低腫瘤增殖率、延長壽命的效果。目前，在國內(nèi)外市場(chǎng)上出現(xiàn)的降脂類藥物除了洛伐他汀以外，還有辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀等，它們的降血脂機(jī)理都與洛伐他汀類似，都是對(duì)洛伐他汀進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造后的一系列的化學(xué)合成藥物，在心血管疾病的治療上起到相當(dāng)大的作用[5]。洛伐他汀可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成的限速酶，3羥3甲基戊二酰輔酶A還原酶，阻斷內(nèi)源性膽固醇的合成。在膽固醇合成的五大步反應(yīng)中，第一步，羥甲基戊二酰 CoA ( HMGCoA) 的形成最關(guān)鍵，此步反應(yīng)中的HMGCoA（3羥基3甲基戊二酰輔酶A）還原酶是限速酶。洛伐他汀是HMGCoA 還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它可使 HMGCoA 還原酶活性下降，從而有效地減少或阻斷體內(nèi)膽固醇的合成[6]。由于可以產(chǎn)生洛伐他汀的野生菌株常常產(chǎn)量很低，所以需要通過對(duì)菌種進(jìn)行誘變，從而提高洛伐他汀的產(chǎn)量。蔣世春等通過微波等離子體（Ｎ＋ 20w，40win），篩選到一株高產(chǎn)菌株，再經(jīng)過發(fā)酵工藝優(yōu)化，%。，隨機(jī)挑單菌落接斜面，待培養(yǎng)成熟后，進(jìn)搖瓶試驗(yàn)，結(jié)果在Ｎ＋ 20w，%的高產(chǎn)株N28，并進(jìn)行傳代產(chǎn)量穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果獲得的菌株生產(chǎn)能力波動(dòng)幅度較小，類似物雜質(zhì)組分比例保持相對(duì)穩(wěn)定[7]。因此，物理誘變劑Ｎ＋微波等離子體選育微生物具有較高的實(shí)用價(jià)植，對(duì)于篩選lovastatin的高產(chǎn)菌株也具有很大的價(jià)值。 紫外線照射是常用的物理誘變方法之一，是誘發(fā)微生物突變的一種非常有用的工具。 ZZ菌株45s以后，再涂不同濃度的LiCl平板，獲得lovastatin含量比對(duì)照組高三倍的菌株，[8]。紫外照射誘變操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，一般實(shí)驗(yàn)室條件都可以達(dá)到，且出現(xiàn)正突變的幾率較高，土曲霉的誘變大多采用這種方法。、超聲波復(fù)合誘變 ，用酶法制備原生質(zhì)體，通過紫外線和超聲波復(fù)合誘變，在超聲波500w，200min以及紫外線30w，30cm處10分鐘，紅曲色素得到提高，洛伐他汀的產(chǎn)量也大大提高[9]。 離子束誘變具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：一是離子束的LET (傳能線密度) 大于X射線和中子, 能產(chǎn)生較高的電離密度，使DNA 產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷，其作用于植物體后可獲得較高的突變頻率和較廣的突變譜，易于篩選出新的突變體；二是離子注入后產(chǎn)生密度很高的電離峰(B ragg 峰)，在B ragg 峰值處，生物組織的損傷較強(qiáng), 在B ragg峰前方損傷小，而在B ragg 峰后方基本不受注入離子的影響；因此輻射損傷區(qū)域只是局部的，所以可在對(duì)生物體損傷較小的情況下, 獲得較多的突變體；三是離子注入造成的損傷不易修復(fù), 突變體穩(wěn)定較快 ；四是可以在電場(chǎng)、磁場(chǎng)的作用下被加速或減速以獲得不同的能量，而且可對(duì)其進(jìn)行高精度的控制，從而可獲得平行束，也可被聚焦成微細(xì)束；在固體內(nèi)的直進(jìn)性好 ；經(jīng)加速后的離子具有一定的靜止質(zhì)量，注入生物體后可以使質(zhì)量、能量和電荷共同作用于生物體；五是可選擇注入的離子種類多樣，而且其質(zhì)量、能量、電荷可有多種組合，所以其產(chǎn)生的誘變結(jié)果和效應(yīng)也是多種多樣的。因此，重離子束在誘變育種的應(yīng)用中具有很大的潛力[10]。微生物在生長和代謝過程中，需要從外界不斷吸收營養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過一系列生物化學(xué)作用，獲得能量并形成新的細(xì)胞物質(zhì)、代謝產(chǎn)物，同時(shí)排出副產(chǎn)物及廢物。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源和氮源的選擇是重中之重[11]。洛伐他汀發(fā)酵生產(chǎn)中，碳源和氮源的選擇對(duì)發(fā)酵過程至關(guān)重要，它們不僅決定菌絲的生長和洛伐他汀的產(chǎn)量，還嚴(yán)重影響發(fā)酵工藝的調(diào)控。一般來說，在氮源限制的條件下，用緩慢利用的碳源發(fā)酵，能取得比較高的洛伐他汀產(chǎn)率和最終產(chǎn)量，同時(shí)氮源的類型也影響洛伐他汀的產(chǎn)率。微生物快速利用的碳源和氮源，如葡萄糖和蛋白胨等，可導(dǎo)致在發(fā)酵 24～48 h 內(nèi)菌絲不可控制的生長，從而引起發(fā)酵液黏性的上升，溶氧的迅速下降，最終使洛伐他汀的產(chǎn)量下降，但是適量的快速利用碳源和氮源也有利于菌絲的快速生長，這一點(diǎn)已廣泛用于種子培養(yǎng)基及發(fā)酵前期的菌絲生長。緩慢利用的碳源和氮源，如麥芽糊精等能更好地提高洛伐他汀的產(chǎn)量，并且有利于最佳菌球形態(tài)的形成；同樣緩慢利用的乳糖和豆餅粉也是不錯(cuò)的組合。還有研究發(fā)現(xiàn)用甘油作為碳源，能大幅度提高洛伐他汀的產(chǎn)量[12]。因此現(xiàn)在已開始有采用乳糖、甘油、葡萄糖混合式碳源和蛋白胨、豆餅粉、玉米漿混合式氮源的方法組合配方，取得了不錯(cuò)的效果[13]。碳氮比例的研究，氮源一般是營養(yǎng)限制性因素，直接決定了最終菌絲濃度的大小，當(dāng)?shù)礉舛认嗤瑫r(shí)，最終的菌絲濃度不會(huì)有大的差異；而碳源對(duì)菌絲濃度幾乎沒有影響，然而在氮源濃度不變的情況下，增加碳源的量，就能大幅度增加洛伐他汀的產(chǎn)量。所以說洛伐他汀發(fā)酵過程中，在保證合適菌絲濃度的前提下，適當(dāng)選擇一個(gè)比較高的碳氮比例，能大幅度提高洛伐他汀的產(chǎn)量。Ykema 等對(duì) C/ N 比例進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn) C/ N 質(zhì)量比在 15∶1 到 60∶1 之間時(shí) ,比較適合洛伐他汀發(fā)酵。而Casas L243。pez 等研究進(jìn)一步表明，40∶1 的 C/N 比較合適。Hassan Hajjaj 等研究發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖和谷氨酸鹽組成培養(yǎng)基，當(dāng)葡萄糖消耗盡時(shí)，洛伐他汀才開始合成，而以乳糖為培養(yǎng)基碳源時(shí)，乳糖幾乎沒有消耗，洛伐他汀就已經(jīng)開始合成?？偟膩碚f，洛伐他汀的合成發(fā)生在氮源受限的靜止期，在這個(gè)時(shí)期，碳被轉(zhuǎn)化成洛伐他汀。也許處于氮源饑餓狀態(tài)，更有利于洛伐他汀的合成。Kimura等在研究Lovastatin合成時(shí)提出：蛋氨酸是Lovastatin合成的重要前體物質(zhì)。而且在Lovastatin合成過程中有甲基化一步，蛋氨酸可能參與了甲基化，所以適量加入蛋氨酸可以提高Lovastatin的產(chǎn)量。Long Shan 等的研究表明，一開始就加入蛋氨酸，Lovastatin的產(chǎn)量并沒有提高，在72 h時(shí)加入適量的蛋氨酸，Lovastatin的產(chǎn)量提高 20 %；而在120 h后加入蛋氨酸，Lovastatin的產(chǎn)量將不會(huì)再有提高。這可能表示，土曲霉控制的聚酮體合成酶被蛋氨酸激活了。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，單單加入 L蛋氨酸反而大大降低洛伐他汀的產(chǎn)量 ，D蛋氨酸在72 h加入會(huì)產(chǎn)生和加入蛋氨酸消旋體一樣的效果[14]。 pH值pH值是影響微生物生長的重要參數(shù)，對(duì)微生物生長、代謝和產(chǎn)物的形成都有很大影響，pH的變化是菌體代謝變化的綜合反應(yīng)，從它的變化中可以推測(cè)出菌體生長代謝及抗生素合成的基本狀態(tài)。不同的微生物對(duì)最適 pH 的要求也不同。Lovastatin發(fā)酵最適的 pH 取決于所采用的微生物并與培養(yǎng)基的成分有關(guān)[15,16]。土曲霉發(fā)酵Lovastatin生產(chǎn)中最適pH 值一般在 ～ 內(nèi)，最小值出現(xiàn)在 48 h，這恰好是土曲霉中Lovastatin重要合成基因——聚酮體合成酶基因 pksM 轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時(shí)期，這可能也是培養(yǎng)基優(yōu)化的重要參考。溫度是微生物發(fā)酵的一個(gè)重要參數(shù)，因此溫度的確定非常重要。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在較高和較低溫度條件下，紅曲霉生長緩慢，產(chǎn)品得率較低，溫度在 30℃左右時(shí)，菌絲生長較快。產(chǎn)品得率也較高。在固態(tài)發(fā)酵時(shí)，孢子萌發(fā)及菌絲生長都需要適宜的水分，因此控制基質(zhì)含水量是固態(tài)發(fā)酵過程中的重要環(huán)節(jié)之一。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含水量較少時(shí)，菌體生長情況很差，發(fā)酵液中Lovastatin的含量也很低；含水量增加到40％時(shí)，發(fā)酵的第 2天菌體長勢(shì)良好，由于有較多的熱量產(chǎn)生，2天后物料開始結(jié)塊，底部有紅色粘稠液體產(chǎn)生；而含水量較多時(shí)，物料也出現(xiàn)結(jié)塊，卻不再產(chǎn)生游離水，物料發(fā)酵較透，干物質(zhì)的得率明顯低于含水量的20％時(shí)?？赡苁窃谂囵B(yǎng)基滅菌時(shí)，適宜的含水量使大米內(nèi)的顆粒排列疏松，有利于菌絲體快速繁殖。菌體對(duì)底物的迅速代謝過程中生成一定量的水，彌補(bǔ)了發(fā)酵過程中水分的揮發(fā)，使固態(tài)培養(yǎng)基維護(hù)較高的含水量。這種良好的水的微環(huán)境有助于淀粉酶的擴(kuò)散心臟淀粉水解后葡萄糖和其他鹽類的擴(kuò)散，可更快地被菌體吸收利用。當(dāng)含水量較多時(shí)，滅菌時(shí)會(huì)使基質(zhì)變得粘稠，孔隙小，在培養(yǎng)過程中通氣性變差，使Lovastatin的產(chǎn)量降低。結(jié)果顯示，40％含水量時(shí)Lovastatin的產(chǎn)率最高[17]。大規(guī)模發(fā)酵中由于水質(zhì)的影響，容易造成磷的匱乏，因此有時(shí)需在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽?；贚ee Hendrickson提出的洛伐他汀生物合成路線的推測(cè) ,醋酸鹽、琥珀酸鹽和檸檬酸鹽對(duì)洛伐他汀發(fā)酵的影響也在研究。在pacin發(fā)酵中已有報(bào)告，琥珀酸鹽和檸檬酸鹽的添加的確能提高發(fā)酵產(chǎn)量，醋酸鹽則抑制其發(fā)酵產(chǎn)量[18]。國際上對(duì)洛伐他汀的首次報(bào)道來自 A. Endo等。1976 年，東京大學(xué)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室的 Akira Endo從泰國食品中分離出來 Monascus 菌株，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生洛伐他汀。其培養(yǎng)基組成為：6 %葡萄糖、 %蛋白胨、 %玉米油、0. 5 %氯化氨。 經(jīng) 28 ℃需氧培養(yǎng)10d，所得發(fā)酵液經(jīng)處理可得到無色的洛伐他汀晶體。溶于苯過濾濃縮乙酯提取棄不溶物溶液發(fā)酵液上清液乙酯提取液油狀物水相有機(jī)相與上步有機(jī)相合并濃縮調(diào)pH至3 乙酯提兩次堿洗2次有機(jī)相無色洛伐他汀結(jié)晶洛伐他汀結(jié)晶丙酮重晶溶于少量苯油狀物 洛伐他汀提取工藝一Merk 公司[19]也報(bào)道了洛伐他汀菌種及發(fā)酵配方，對(duì)分離純化方法也有詳細(xì)描述。PRCC 18吸附丙酮合并濃縮 凝膠過濾柱 Sephadex L H 20發(fā)酵液離心菌液菌絲洗脫液浸取液洛伐他汀結(jié)晶 洛伐他汀含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展國內(nèi)對(duì)洛伐他汀的測(cè)定始于 20 世紀(jì) 90 年代 ，尤其在 1995 年后有較大發(fā)展。最常見也是最典型的方法是高效液相色譜法，此外還有薄層掃描法和紫外分光光度法。1995 年北京市藥品檢驗(yàn)所的張小茜、周富榮及北大維信生物科技有限公司的石濟(jì)民測(cè)定了降血脂藥物血脂康中的洛伐他汀含量并初步確定了測(cè)定條件。他們用高效液相色譜法（HPLC法）聯(lián)用紫外檢測(cè)器。由紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果表明，洛伐他汀在 230，237，246 nm處有3個(gè)特征峰與對(duì)照溶液的紫外特征峰相一致，由于237 nm 峰較明顯 ,故波長選用 237 nm。他們分別以不同濃度的乙醇及甲醇為溶劑，超聲處理 20 min，再用HPLC法測(cè)其含量，發(fā)現(xiàn)用75 %乙醇為溶劑，提取較完全。對(duì)于提取時(shí)間，用75 %乙醇為溶劑，分別以不同時(shí)間進(jìn)行超聲處理，發(fā)現(xiàn)處理20 min 提取較完全。經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)用中性氧化鋁對(duì)提取的樣品進(jìn)行初步分離效果最好。洗脫劑用甲醇，用量(總用量) 20～25mL。他們還進(jìn)行了其他實(shí)驗(yàn)來確保結(jié)果的可靠性。 %（n=3），精密度Sr (相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)