【正文】 碩士學(xué)位論文酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株選育及應(yīng)用研究一、 概述本項(xiàng)目2004年獲得河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目的立項(xiàng)支持，項(xiàng)目編號(hào)：0424240040。酶是生物細(xì)胞原生質(zhì)合成且具有高度催化活性的蛋白質(zhì)。人類(lèi)早在認(rèn)識(shí)酶之前就知道利用酶為生產(chǎn)和生活服務(wù)，例如釀造、鞣革及制造奶酪等已經(jīng)有幾千年的歷史。1897年B252。chner發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍然能夠使糖液發(fā)酵產(chǎn)生酒精和二氧化碳。二十世紀(jì)初，有更多的酶被發(fā)現(xiàn)和分離提純，注意到了某些酶的作用需要有低分子物質(zhì)（輔酶）的參加，并陸續(xù)認(rèn)識(shí)了很多酶所催化的反應(yīng)。1926年Sumner第一次從刀豆中分離出脲酶并獲得了該蛋白質(zhì)的結(jié)晶。30年代，、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶。今天已有500種酶得到結(jié)晶，2000多種酶得到鑒定，200種左右商品酶已經(jīng)開(kāi)發(fā)，但工業(yè)上應(yīng)用的酶僅有50多種。二次世界大戰(zhàn)后抗生素工業(yè)的通風(fēng)攪拌發(fā)酵技術(shù)的利用，使微生物酶制劑工業(yè)得到迅速發(fā)展。20世紀(jì)40年代末，生產(chǎn)α淀粉酶的液體深層發(fā)酵首先在日本實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，標(biāo)志著現(xiàn)代酶制劑工業(yè)的開(kāi)始。20世紀(jì)50年代后期遺傳工程、蛋白質(zhì)工程等現(xiàn)代生物技術(shù)的研究成果，促使世界酶制劑工業(yè)持續(xù)地高速發(fā)展，成為生物工程四大主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)中最早產(chǎn)業(yè)化的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)。由于酶制劑是一種綠色高效生物催化劑，具有高效、節(jié)能、安全和環(huán)保等特點(diǎn)，對(duì)酶制劑應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品、提高質(zhì)量、節(jié)能降耗、保護(hù)環(huán)境重要意義；因此，這一產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到各國(guó)政府的高度重視，有著廣闊的發(fā)展前景。國(guó)際酶制劑市場(chǎng)目前保持著9％的增長(zhǎng)速度，2010年世界酶制劑年銷(xiāo)售額達(dá)160億美元，目前已有一大批可用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的各種胞外酶的微生物，如芽孢桿菌、大腸桿菌、放線菌、毛霉、黑曲霉、青霉、酵母等。商品化的酶品種數(shù)量主要有糖化酶、α淀粉酶、β淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、凝乳酶、脂肪酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶、葡萄糖苷酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、a乙酰乳酸脫羧酶、乳酸脫氫酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、延胡索酸酶、青霉素?；?、溶菌酶、鏈激酶、漆酶、植酸酶、復(fù)合酶等等。應(yīng)用范圍覆蓋洗滌劑、紡織、酒精、白酒、啤酒、味精、有機(jī)酸、淀粉糖、制藥、制革、飼料、造紙、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等諸多領(lǐng)域，創(chuàng)造工業(yè)附加值數(shù)千億多元。我國(guó)自1965年建立起第一個(gè)專(zhuān)業(yè)酶制劑工廠，由于不斷引進(jìn)技術(shù)、資金和設(shè)備，酶制劑工業(yè)得到迅猛發(fā)展，產(chǎn)量由1965年的10噸增長(zhǎng)到2010年的219萬(wàn)噸，平均每年以20％以上的速度增長(zhǎng)，產(chǎn)值達(dá)6億多元，應(yīng)用范圍愈來(lái)愈廣泛。我國(guó)酶制劑工業(yè)與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，存在的差距主要有：（1）技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)滯后，基礎(chǔ)理論研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)研究嚴(yán)重脫節(jié)，科研資金力度不夠且分散，科研技術(shù)轉(zhuǎn)化能力不強(qiáng)。（2）行業(yè)規(guī)模小而分散，市場(chǎng)調(diào)控能力弱，我國(guó)現(xiàn)有100多家酶制劑生產(chǎn)企業(yè)，企業(yè)數(shù)量占世界三分之一還多，但銷(xiāo)售額僅占世界酶制劑銷(xiāo)售額5％，企業(yè)規(guī)模小、產(chǎn)品的市場(chǎng)覆蓋率低，導(dǎo)致企業(yè)對(duì)市場(chǎng)的調(diào)控能力普遍較弱，企業(yè)間無(wú)序的價(jià)格競(jìng)爭(zhēng)使整個(gè)行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益下滑，使企業(yè)在技術(shù)創(chuàng)新、新品種開(kāi)發(fā)、設(shè)備更新等方面力量不足，嚴(yán)重制約了酶制劑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。（3）產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不合理，技術(shù)落后。我國(guó)酶制劑產(chǎn)品主要是以糖化酶、淀粉酶、蛋白酶為主，三者加起來(lái)占據(jù)全國(guó)酶制劑產(chǎn)量的97％，全國(guó)一半以上企業(yè)生產(chǎn)品種單一，抗市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)非常弱。（4）酶制劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)力度不夠，制約了酶制劑企業(yè)的市場(chǎng)開(kāi)拓能力。，相對(duì)分子質(zhì)量為30000—40000。酸性蛋白酶主要來(lái)源于動(dòng)物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據(jù)其產(chǎn)生菌的不同，微生物蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔(dān)子菌酸性蛋白酶。根據(jù)作用方式可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是與胃蛋白酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類(lèi)是與凝乳酶相似，主要產(chǎn)酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業(yè)中。國(guó)外關(guān)于酸性蛋白酶的研究和生產(chǎn)從20世紀(jì)初就開(kāi)始了。乞今為止，已發(fā)現(xiàn)不少微生物可以產(chǎn)生酸性蛋白酶，如黑曲霉（Aspergillus niger）、大孢子黑曲霉突變株（A. niger var. macrosporus）、齋藤曲霉（A. saitoi）、宇佐美曲霉（A. usamii）、泡盛酒曲霉（A. awamori）、微紫青霉（Pen. janthinellum）、常規(guī)青霉（Pen. frequentens）、杜邦青霉（Pen. dupoti）、宛氏擬青霉（Paecilomyces varioti）、小孢米曲霉突變株（A. oryzacvar. microsporus）、根霉（Rhizopus sp.）、微小毛霉（M. pusillus）、粘紅酵母（Rhdotorula glutinis）、粟疫霉（Endothia parasitica）、血紅色陀螺孔菌（Trametes sanguinca）、芽枝霉（Cladosporium sp.）等。1903年，德國(guó)科學(xué)家從動(dòng)物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。1911年美國(guó)科學(xué)家從木瓜中提取木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白渾濁物。自1954年吉田首次發(fā)現(xiàn)黑曲霉可產(chǎn)生酸性蛋白酶以來(lái)，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)酸性蛋白酶進(jìn)行了廣泛的研究。1964年國(guó)外科學(xué)家發(fā)現(xiàn)大孢子黑曲霉突變體能產(chǎn)生兩種不同的酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌產(chǎn)酸性蛋白酶，并對(duì)該酶進(jìn)行了純化和結(jié)晶。1968年從微小毛霉發(fā)酵物中篩選出一種酸性蛋白酶，并對(duì)其進(jìn)行了純化和酶學(xué)性質(zhì)分析。1995年國(guó)外科學(xué)家對(duì)煙曲霉酸性蛋白酶的基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序。2001年又從假絲酵母中篩選出一種酸性蛋白酶菌株，并對(duì)該酶進(jìn)行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前為止，國(guó)外科學(xué)家對(duì)酸性蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能等已經(jīng)進(jìn)行了廣泛系統(tǒng)的研究。微生物產(chǎn)酸性蛋白酶我國(guó)從上世紀(jì)60年代就開(kāi)始研制，1970年上海工業(yè)微生物研究所首先從黑曲霉篩選一株3．350產(chǎn)酸性蛋白酶菌株，填補(bǔ)了我國(guó)酸性蛋白酶制劑的空白。但3．350酸性蛋白酶菌種發(fā)酵活力較低，生產(chǎn)工藝較繁雜。1977年中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉經(jīng)誘變、篩選的537高產(chǎn)酸性蛋白酶菌種。近年來(lái)國(guó)內(nèi)在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于選育產(chǎn)酶活力高、抗逆性好的菌種。目前用于酸性蛋白酶生產(chǎn)的菌種主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它們突變株。錢(qián)玉英等（1994年）用60Coγ射線誘變處理黑曲霉CPu菌株，獲得突變菌株6042，產(chǎn)酶活力比出發(fā)菌株提高近4倍。章劍林等（1995年）以黑曲霉為出發(fā)菌株，采用高溫、超劑量常規(guī)誘變方法，獲得了產(chǎn)耐高溫酸性白酶的菌株S315，最適溫度為50℃，90℃%。黃遵錫等(1999年)以黑曲霉YM3019為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和亞硝基胍誘變處理，獲得高產(chǎn)酶菌株A11，產(chǎn)酶活力約是原始出發(fā)菌株的4倍。李永泉等（1999年），對(duì)宇佐美曲霉所產(chǎn)的酸性蛋白酶進(jìn)行了發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)研究。戚淑威等（2006年）對(duì)青霉產(chǎn)酸性蛋白酶的適宜條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。謝必峰等（2007）采用硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分離純化了黑曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶，并對(duì)其氨基酸組分進(jìn)行了分析。王云（2008年）通過(guò)質(zhì)譜指紋法對(duì)黑曲霉發(fā)酵液中所產(chǎn)蛋白進(jìn)行了分析比對(duì)和鑒定酸性蛋白酶分子生物學(xué)方面的研究。 國(guó)內(nèi)生產(chǎn)酸性蛋白酶的廠家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產(chǎn)。早期生產(chǎn)的微生物酸性蛋白酶，只是工業(yè)級(jí)的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過(guò)液體通風(fēng)發(fā)酵，成熟發(fā)酵醪再經(jīng)硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流（沸騰）干燥、粉碎、化驗(yàn)、包裝制成工業(yè)級(jí)酸性蛋白酶。隨著現(xiàn)代超濾膜濃縮技術(shù)在酶制劑行業(yè)上的應(yīng)用，近幾年生產(chǎn)了食品級(jí)酸性蛋白酶制劑。食品酸性蛋白酶發(fā)酵與工業(yè)級(jí)相同，只是后提取不同，成熟發(fā)酵醪進(jìn)入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀再經(jīng)板框壓濾機(jī)壓濾，濾清液經(jīng)超濾膜濃縮器濃縮經(jīng)化驗(yàn)合格，加入防腐劑、穩(wěn)定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑。二、酸性蛋白酶制劑的作用機(jī)理和酶學(xué)特性酸性蛋白酶的作用機(jī)理酸性蛋白酶是一種天冬氨基蛋白酶，分子質(zhì)量為30~40KD, 在其活性中心有兩個(gè)天冬氨基殘基，其代表性特征是能夠在酸性或中性環(huán)境條件下水解動(dòng)植物蛋白質(zhì)，將兩個(gè)疏水氨基酸打斷，通過(guò)內(nèi)切和外切作用將蛋白質(zhì)水解為小肽和氨基酸。微生物酸性蛋白酶對(duì)肽鍵兩端的苯環(huán)和大的氨基酸基團(tuán)有較高的專(zhuān)一性，酸性蛋白酶的催化機(jī)理是酸堿催化作用，由活性位點(diǎn)的兩個(gè)天冬氨酸在酸性或堿性條件下交替發(fā)揮作用，其中一個(gè)天冬氨酸失去質(zhì)子，另一個(gè)天冬氨酸則被質(zhì)子化。由于飼用酶進(jìn)行催化反應(yīng)在畜禽消化道內(nèi)進(jìn)行，故其作用條件必須與動(dòng)物消化道生理?xiàng)l件相適應(yīng)，而通常豬和家禽消化道內(nèi)溫度為40℃ 左右，—，小腸pH5—7，與酸性蛋白酶作用的一些基本參數(shù)相吻合。畜禽尤其是幼齡動(dòng)物的消化道內(nèi)蛋白酶分泌體系發(fā)育不健全而在生長(zhǎng)的中后期，自身雖有內(nèi)源酶，但尚顯不足，當(dāng)采用高蛋白飼料飼養(yǎng)時(shí)，因其對(duì)飼料蛋白質(zhì)消化能力較差而易引起腹瀉等疾病。尤其是斷奶仔豬，消化道發(fā)育不成熟，消化酶分泌系統(tǒng)不健全，特別是胃酸分泌不足，免疫功能低下，加上斷奶時(shí)的生理、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分不易消化和吸收，對(duì)病原微生物的抵抗力較弱，易造成正常腸道菌群平衡紊亂，經(jīng)常出現(xiàn)較高的腹瀉率，導(dǎo)致早期生長(zhǎng)受阻。若在飼料中添加酸性蛋白酶，則能補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，使高分子的蛋白質(zhì)降解為低分子的肽、胨及各種氨基酸，而易被畜禽消化吸收，從而降低飼料對(duì)斷奶仔豬消化道的刺激，降低應(yīng)激反應(yīng)，減少營(yíng)養(yǎng)障礙，提高飼料利用率，促進(jìn)生長(zhǎng)。 酸性蛋白酶的酶學(xué)特性酸性蛋白酶是一類(lèi)具有復(fù)雜理化性質(zhì)的化合物，不同微生物菌種分泌的酸性蛋白酶雖具有一些共同的性質(zhì)，但在底物pH值、特異性、抑制劑、激活劑等方面均存在著一定的差異。(1)pH對(duì)酶活及酶穩(wěn)定性的影響～，但不同的微生物所產(chǎn)酶的最適作用有所不同。曲霉屬酸性蛋白酶最適作用pH值為2．5～4．0，～。齋藤曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為2．0～3．0，～。米曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為3．0～4．0，～。，～。青霉屬所產(chǎn)酸性蛋白酶最適作用pH值為2．0～3．0，～。酸性蛋白酶對(duì)pH值的要求，與酶活性中心的羧基有關(guān)。 （2）溫度對(duì)酶活性及穩(wěn)定性影響 酸性蛋白酶一般在50℃以下較為穩(wěn)定，但也隨產(chǎn)酶微生物的不同而有所差異。如根霉屬所產(chǎn)酸性蛋白酶在30℃下只能保持30分鐘，而曲霉屬的齋藤曲霉所產(chǎn)酸性蛋白酶在50℃穩(wěn)定，55℃處理10分鐘才會(huì)失活。黑曲霉Vs、V315 菌株所產(chǎn)酸性蛋白酶在80℃保溫2小時(shí) 后仍有90%的酶活力存在。青酶屬產(chǎn)的門(mén)冬氨酸蛋白酶，最適pH值條件下，50℃時(shí)達(dá)到最大酶活。酵母菌所產(chǎn)酸性蛋白酶經(jīng)60℃處理后還剩少許酶活力，經(jīng)70℃處理后酶活完全喪失。（3）金屬離子對(duì)酶活力的影響Ag＋ 對(duì)酸性蛋白酶有輕度抑制作用，當(dāng)其濃度為5mol/L時(shí)，酶活下降15% 。Cu2＋、Mn2＋對(duì)其有激活作用，當(dāng)Cu2＋，對(duì)酶有明顯的激活作用；Cu2＋、Mn2＋ 和Al3＋同時(shí)添加時(shí)，對(duì)酶有協(xié)同作用，使酶活提高1倍；Ca2＋本身并不抑制酸性蛋白酶的活性，但它可作為其它物質(zhì)的輔助因子而對(duì)某些酸性蛋白酶產(chǎn)生抑制作用。液體酸性蛋白酶，長(zhǎng)時(shí)間存放碳鋼罐中失活較多。（4）抑制劑對(duì)酶活力的影響通常酸性蛋白酶的活性中心肽段是基本相似的，抑制劑主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸鈉。霉菌來(lái)源的酸性蛋白酶通常并不受胃蛋白酶抑制劑—對(duì)溴苯的抑制，但卻對(duì)N溴代琥珀酰亞胺和高錳酸鉀敏感。此外，并非每種酸性蛋白酶都會(huì)被胃蛋白酶抑制劑或鏈霉素胃蛋白酶抑制劑(SPI) 抑制,這可能與酶的活性部位含酪氨酸以及色氨酸有關(guān)。三、酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株（Aspergillus niger—Y06）的選育研究材料和方法　實(shí)驗(yàn)材料 出發(fā)菌株黑曲霉（Aspergillus niger）中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，CICC編號(hào)：1. 1. 2　培養(yǎng)基1. 1. 2. 1　分離及斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基, 分離培養(yǎng)基是在察氏培養(yǎng)基中加入1%的酪蛋白。PDA培養(yǎng)基：取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水煮爛（煮沸20~30分鐘，能被玻璃棒戳破即可），用四層紗布過(guò)濾，加葡萄糖 20克，瓊脂 1520克，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，自然PH，分裝試管，加塞、包扎，（121℃）滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩２焓吓囵B(yǎng)基：硝酸鈉3g 、磷酸氫二鉀1g 、硫酸鎂(MgSO47H2O) 、蔗糖30g、瓊脂20g 、蒸餾水1000mL ，加熱溶解，自然PH，分裝后121℃滅菌20min。 。1. 1. 2. 2　固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基麩皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2，每1 kg 培養(yǎng)基中添加硫酸銨 %, 水750 ml, 。1. 1. 2. 3　液體發(fā)酵培養(yǎng)基% , % , %, % , CaCl2 % , Na2HPO4 %, 豆餅水解液6%, 。實(shí)驗(yàn)方法2. 1　菌種的分離和純化采用常規(guī)稀釋分離法。2. 2　菌株的誘變處理2. 2. 1　紫外線誘變處理用接種環(huán)取新鮮PDA斜面上的黑曲霉孢子少許, 加入無(wú)菌水中進(jìn)行稀釋,用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù), 使每毫升溶液中孢子量約為5000 個(gè), ml涂布初篩平板, 30℃培養(yǎng)4 h, 讓孢子萌發(fā), 紫外燈預(yù)熱30min后，將平皿放置距離紫外燈30cm處分別照射4 min、6 min、8min、1 0min、12min，隨后用5mL無(wú)菌生理鹽水將平皿上的菌洗脫，適當(dāng)稀釋后，涂布于分離平皿，以黑布包裹30℃培養(yǎng)34天，從長(zhǎng)出菌落與其水解圈直徑比的大小及菌落形態(tài)的變化，挑選所需菌種。 2. 2. 2 　亞硝基胍誘變處理用接種環(huán)取新鮮PDA 斜面上的黑曲霉孢子少許, 加入無(wú)菌水中進(jìn)行稀釋, 用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù), 使每毫升溶液中孢子量約為5 000個(gè), 取3ml孢子懸液, 加入等體積的亞硝基胍溶液, 充分混合, 于31℃振蕩處理1h