【正文】 生物化學 第一章 一、 蛋白質(zhì)的生理功能 蛋白質(zhì)是生物體的基本組成成分之一，約占人體固體成分的 45%左右。蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)分布廣泛，幾乎存在于所有的組織器官中。蛋白質(zhì)是一切生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是各種生命功能的直接執(zhí)行者，在物質(zhì)運輸與代謝、機體防御、肌肉收縮、信號傳遞、個體發(fā)育、組織生長與修復(fù)等方面發(fā)揮著不可替代的作用。 二、 蛋白質(zhì)的分子組成特點 編碼氨基酸 :自然界存在的氨基酸有 300 余種，構(gòu)成人體蛋白質(zhì)的氨基酸只有 20種，且具有自己的遺傳密碼。 2. 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為 16％。 每 100mg樣品中蛋白質(zhì)含量（ mg%）：每克樣品含氮質(zhì)量（ mg） 100。 3. 氨基酸的分類 所有的氨基酸均為 L 型氨基酸（甘氨酸 ） 除外。 根據(jù)側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)， 20 種氨基酸分為四類。 （ 1） 非極性疏水性氨基酸：甘氨酸（ Gly）、丙氨酸（ Ala）、纈氨酸（ Val）、亮氨酸（ Leu）、異亮氨酸（ Ile）、苯丙氨酸（ Phe）、脯氨酸（ Pro）。 （ 2） 極性中性氨基酸：色氨酸（ Trp）、絲氨酸（ Ser）、酪氨酸（ Tyr）、半胱氨酸（ Cys）、蛋氨酸（ Met）、天冬酰胺（ Asn）、谷胺酰 胺（ gln）、蘇氨酸（ Thr）。 （ 3） 酸性氨基酸：天冬氨酸（ Asp）、谷氨酸（ Glu）。 （ 4） 堿性氨基酸：賴氨酸（ Lys）、精氨酸（ Arg）、組氨酸（ His）。 ?含有硫原子的氨基酸：蛋氨酸（又稱為甲硫氨酸）、半胱氨酸（含有由硫原子構(gòu)成的巰基－ SH）、胱氨酸（由兩個半胱氨酸通過二硫鍵連接而成）。 ?芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。 ?唯一的亞氨基酸：脯氨酸，其存在影響α 螺旋的形成。 ?營 養(yǎng)必需氨基酸：八種，即異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸?？捎靡痪湓捀爬?“一家寫兩三本書來”，與之諧音。 氨基酸的理化性質(zhì) 1. 氨基酸的兩性解離性質(zhì)：所有的氨基酸都含有能與質(zhì)子結(jié)合成 NH4＋的氨基；含有能與羥基結(jié)合成為COO－的羧基，因此，在水溶液中，它具有兩性解離的特性。在某一 pH 環(huán)境溶液中，氨基酸解離生成的陽郭子及陰離子的趨勢相同，成為兼性離子。此時環(huán)境的 pH 值稱為該氨基酸的等電點（ pI），氨基酸帶有的凈電荷為零，在電場中不泳動。 pI 值的計算如下： pI＝ 1/2（ pK1 + pK2） ,(pK1 和 pK2 分別為α 羧基和α 氨基的解離常數(shù)的負對數(shù)值 )。 2. 氨基酸的紫外 吸收性 質(zhì) （ 1） 吸收波長： 280nm （ 2） 結(jié)構(gòu)特點：分子中含有共軛雙鍵 （ 3） 光譜吸收能力：色氨酸＞酪氨酸＞苯丙氨酸 （ 4） 呈色反應(yīng)： 氨基酸與茚三酮水合物共加熱，生成的藍紫色化合物在 570nm 波長處有最大吸收峰；藍紫色化合物＝（氨基酸加熱分解的氨）＋（茚三酮的還原產(chǎn)物）＋（一分子茚三酮）。 三、 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)特點 見表 11。 表 11 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的比較 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu) 定 義 指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序 蛋白質(zhì)主鏈的局部空間結(jié)構(gòu)、不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈構(gòu)象 整條肽鏈中所有原子在三 維空間的排布位置 各亞基間的空間排布 表現(xiàn)形式 － α 螺旋、β 折疊（片層）、β 轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲 結(jié)構(gòu)域、模 體 （鋅指結(jié)構(gòu)） 亞基聚合 維系鍵 肽 鍵 (主要 ) 二硫鍵 (次要 ) 氫 鍵 次級鍵（疏水作用、鹽鍵、氫鍵、范德華力） 亞基間的次級鍵 特 殊 － 脯氨酸的存在或者多個谷、天冬氨酸的存在都會干擾α 螺旋的形成 － － 體： 蛋白質(zhì)分子中，由兩個以上具有二級結(jié)構(gòu)的肽段在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象并發(fā)揮特定的作用。 ：是一個典型的模體，由一個α 螺旋和二個反平衡的β 折疊的 3個肽段組成，具有結(jié)合鋅離子的功能。 ： 能夠可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，引導(dǎo)肽鏈正確折疊的存在于細胞內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，也對蛋白質(zhì)二硫鍵正確形成起到重要作用。 四、 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系 ，具有相似一級結(jié)構(gòu)的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象及功能也相似。 ： 由于蛋白質(zhì)分子一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其功能改變而產(chǎn)生的疾病。 五、 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 ，其空間結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)。 （ Hb）由四個亞基組成，兩 個α亞基，兩個β亞基。記憶要點如下： (1)血紅蛋白分子存著緊張態(tài)（ T）和松弛態(tài)（ R）兩種不同的空間構(gòu)象。 (2)T型和氧分子親和力低， R型與氧分子的親和力強，四個亞基與氧分子結(jié)合的能力不一樣。 (3)第一個亞基與氧分子結(jié)合后，使 Hb分子空間構(gòu)象發(fā)生變化，引起后一個亞基與氧分子結(jié)合能力加強(正協(xié)同效應(yīng) )。 (4)肌紅蛋白分子只有一個亞基，不存在變構(gòu)效應(yīng) ：指一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中的另一個亞基與配體的結(jié)合能力。促進作用則為正協(xié)同效應(yīng)；反之為負協(xié)同效應(yīng)。 ： 蛋白質(zhì)分子的 亞基與配體結(jié)合后，引起蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化的現(xiàn)象。 ：大分子蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結(jié)構(gòu)域。 瘋牛?。菏怯呻貌《镜鞍滓鸬囊唤M人和動物神經(jīng)退行性病變，具有傳染性、遺傳性或散在發(fā)病的特點。生物體內(nèi)含有正常的α 螺旋形式的 PrPc，轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓５摩?折疊形式的 PrPSc具有致病性。 六、 蛋白質(zhì)重要的理化性質(zhì)及相關(guān)概念 ： 當?shù)鞍踪|(zhì)在某一 pH 溶液中時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，成為兼性離子，帶有的凈電荷為零，此時溶液的 pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點。 (1)體內(nèi)的蛋白質(zhì)等電點各不相同，大多數(shù)接近于 (2)堿性蛋白質(zhì)：魚精蛋白、組蛋白 酸性蛋白質(zhì)：胃蛋白酶、絲蛋白 (3)蛋白質(zhì)處于大于其等電點的 pH 值溶液中時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷。反之則帶有正電荷。 ：水化膜、表面電荷。 ： 在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，導(dǎo)致理化性質(zhì)的改變和生 物活性的喪失。 (1)變性的本質(zhì)：二硫鍵與非共價鍵的破壞，不涉及肽鍵的斷裂 (2)變性后特點：生物學活性喪失、溶解度下降、粘度增 加、結(jié)晶能力消失、易被蛋白酶水解 (3)變性的因素：加熱、乙醇、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等 (4)蛋白質(zhì)復(fù)性：變性程度較輕，去除變性因素后，仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能 (5)蛋白質(zhì)的凝固作用：蛋白質(zhì)經(jīng)強酸或強堿變性后，仍能溶解于該溶液中。若調(diào)節(jié) pH值至其等電點時，變性蛋白質(zhì)呈絮狀析出，再加熱，形成堅固的凝塊。 蛋白質(zhì)的復(fù)性： 若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性。 ： 含有具有共軛雙鍵的三種芳香族氨基酸，于 280nm波 長處有特征吸收峰。 ： (1)茚三酮反應(yīng)：蛋白質(zhì)水解后可產(chǎn)生游離的氨基酸，原理同前 (2)雙縮脲反應(yīng)：肽鍵與堿性硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色。氨基酸不出現(xiàn)此反應(yīng)，當?shù)鞍踪|(zhì)不斷水解時，氨基酸濃度上升，其雙縮脲呈色濃度逐漸下降，因此可以檢測蛋白質(zhì)的水解程度。 七、 蛋白質(zhì)的分離純化 析： 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 ： 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜的方法。 ： 04℃低溫；丙酮的體積 10倍于被沉淀蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)沉淀后應(yīng)迅速 分離。 析： 硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等中性鹽放入蛋白質(zhì)溶液中，破壞水化膜并中和表面電荷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素去除而沉淀。 ： 利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，形成抗原抗體復(fù)合物，從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白的方法。 泳： 蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點的溶液中，受到電場力的作用向正極或負極泳動。 (1)SDSPAGE電泳： 加入負電荷較多的 SDS（十二烷基磺酸鈉），導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的電荷差異消失，此時蛋白質(zhì)在電場中的泳動速率只和蛋白質(zhì)顆粒大小有關(guān)，用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 (2)等電聚焦電泳： 在電場中形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性 pH梯度，電泳時被分離的蛋白質(zhì)泳動至其等電點相等的 pH值區(qū)域時，凈電荷為零不再受電場力移動，該法用于根據(jù)蛋白質(zhì)等電點的差異進行分離。 (3)層 析： 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。 ：負電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫 ：分子量大的蛋白質(zhì)最先洗脫 ： 既可分離純化蛋白質(zhì)也可 測定蛋白質(zhì)的分子量； 對于球形蛋白質(zhì)而言，沉降系數(shù) S大體上和分子量成正比關(guān)系 S（未知） /S（標準）＝｛ Mr（未知） /Mr（標準）｝ 2/3 八、 多肽鏈氨基酸序列分析方法及關(guān)鍵試劑名稱 氨基酸序列分析 ：分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸組成 ：測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸。以前用二硝基氟苯，現(xiàn)多用丹酰氯 ：將肽鏈水解成片段（ 表 12）。 表 12 三種肽鏈水解方式的比較 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白質(zhì)酶 溴化氫法 作用部位 賴氨酸或精氨酸羧基側(cè)的肽鍵 芳香族氨基羧基側(cè)的肽鍵 甲硫 氨酸羧基側(cè)的肽鍵 ：測定各肽段的氨基酸排列順序，采用 Edman降解法，試劑為異硫氰酸苯酯 ：統(tǒng)計學分析，組合排列對比，得到完整肽鏈氨基酸排列順序 通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列的步驟： ： 分離編碼蛋白質(zhì)的基因 ： 測定 DNA序列 ： 排列出 mRNA序列 ： 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量測定：圓二色光譜法，測α 螺旋較多的蛋白質(zhì)時，結(jié)果較為準確。 蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)測定： X射線衍射法和磁共振技術(shù)。 第二章 一、 核酸的分類、細胞分布、核酸元素組成特點及堿基、核苷、核苷酸的化學結(jié)構(gòu) ，是一切生物體所含有的最重要的生物大分子之一。天然存在的核酸根據(jù)其分子的物質(zhì)組成不同分為兩大類： DNA與 RNA。 ：主要由碳、氫、氧、氮、磷組成，磷的含量較為穩(wěn)定，占核酸總量的 910%。 ：核酸的基本組成是核苷酸。 二、 核苷酸間的連接方式 3’,5’磷酸二酯鍵； 5’末端是指在 DNA或 RNA鏈中末端為 5’磷酸基，未形成磷酸二酯鍵的一端； 3’末端是指在 DNA或 RNA鏈中末端為 3’OH，未被酯化的一端； 各種簡化式書寫時都是 5’→ 3’，其讀向都是從左到右，所表示的堿基序列也都是從 5’端到 3’端。 三、 兩類核酸（ DNA與 RNA）性質(zhì)的異同 詳見表 21。 表 21 DNA與 RNA性質(zhì)的比較 DNA RNA 名稱 脫氧核糖核苷酸 核糖核苷酸 堿基組成 A、 T、 C、 G A、 U、 C、 G 戊糖組成 β D2脫氧核糖 β D核糖 類型 DNA mRNA、 tRNA、 rRNA等 核苷酸 /脫氧核苷酸 dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP ATP、 UTP、 CTP、 GTP 分布部位 98%在細胞核中 2%在線粒體中 90%分布于胞液 10%分布于細胞核 基本結(jié)構(gòu) 反向平行互補雙螺旋 單鏈無規(guī)卷曲 與蛋白質(zhì)的結(jié)合 主要與組蛋白結(jié)合 rRNA與核蛋白體結(jié)合 稀有堿基 不含有 tRNA含有 1020%的稀有堿基 主要生物學功能 儲存遺傳信息 傳遞及表達遺傳信息 理化性質(zhì) 多元酸、線性高分子、粘度大 易在機械力作用下斷裂 分子小，粘度小 純品時 OD260/OD280 磷 酸 磷 酸 核苷酸 核 糖 堿 基 核酸分子 核 苷 連接鍵 3’ ,5’ 磷酸二酯鍵 光波最大吸收值 260nm附近 四、 DNA的一級結(jié)構(gòu)、 二級結(jié)構(gòu)要點 及 堿基配對規(guī)律 ，了解 DNA的高級結(jié)構(gòu)形式 詳見表 22。 表 22 DNA分子結(jié)構(gòu)的比較 DNA一級結(jié)構(gòu) DNA二級結(jié)構(gòu) DNA高級結(jié)構(gòu) 定義 核苷酸的排列順序 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 在雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進一步折疊，在蛋白質(zhì)的參與下組裝成為的致密結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)特點 堿基的排列順序 3’ ,5’ 磷酸二酯鍵 反向、平行、互補、雙鏈 右手螺旋結(jié)構(gòu) DNA結(jié)構(gòu)的多樣性 核小體、核小體卷曲及柱狀結(jié)構(gòu)折疊等形成超螺旋形式 穩(wěn)定性的維系 磷酸二酯鍵 縱向：堿基的堆積力 橫向：配對的氫鍵 － 五、 mRNA、 tRNA二級結(jié)構(gòu) 特點及 rRNA的類型和其它小分子 RNA mRNA、 tRNA、 rRNA結(jié)構(gòu)特點見 表 23。 其它小分子 RNA種類及功能見 表 24。 表 23 三種常見 RNA的比較 mRNA tRNA rRNA 名稱 信使 RNA 轉(zhuǎn)運 RNA 核糖體 RNA 主要功能 蛋白質(zhì)合成的直接模板 氨基酸的運載載體 核蛋白體的組成成分 蛋白質(zhì)合成的場所