酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究(已修改)
2025-06-07 22:00 本頁(yè)面
【正文】 學(xué)習(xí)酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。 學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、有機(jī)溶劑分級(jí)和離子交換柱層析技術(shù)。 本實(shí)驗(yàn)可以為大家提供一個(gè)較全面的實(shí)踐機(jī)會(huì)，學(xué)習(xí)如何提取純化、分析鑒定一種酶，并對(duì)這種酶的性質(zhì)，尤其是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)作初步的研究。 酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究 自 1860年 Bertholet從啤酒酵母（ Sacchayces Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來(lái)，它已被廣泛地進(jìn)行了研究。蔗糖酶（ invertase）（ βD呋喃果糖苷果糖水解酶）（ ）特異地催化非還原糖中的 β呋喃果糖苷鍵水解，具有相對(duì)專一性。不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 實(shí)驗(yàn)原理 本實(shí)驗(yàn)提取啤酒酵母中的蔗糖酶。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為 外蔗糖酶 ，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)中的稱之為 內(nèi)蔗糖酶 ，含有少量的糖。兩種酶的蛋白質(zhì)部分均為雙亞基，二聚體，兩種形式的酶的氨基酸組成不同，外酶每個(gè)亞基比內(nèi)酶多兩個(gè)氨基酸， Ser和 Met，它們的分子量也不同，外酶約為 27萬(wàn) (或 22萬(wàn)，與酵母的來(lái)源有關(guān) )，內(nèi)酶約為 。盡管這兩種酶在組成上有較大的差別，但其底物專一性和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)仍十分相似，因此，本實(shí)驗(yàn)未區(qū)分內(nèi)酶與外酶，而且由于內(nèi)酶含量很少，極難提取，本實(shí)驗(yàn)提取純化的主要是外酶。 名稱 MW 糖含量 亞基 為蔗糖的 Km 為棉子糖的 Km pI 最適 pH 穩(wěn)定 pH 最適溫度 外酶 27萬(wàn) 50% 雙 26mM 150 mM 60℃ 內(nèi)酶 ＜ 3% 雙 25mM 150 mM 60℃ 實(shí)驗(yàn)中，用測(cè)定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來(lái)測(cè)定蔗糖水解的速度，在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。 兩種酶的性質(zhì)對(duì)照表如下： 一、蔗糖酶的提取與部分純化 二、離子交換柱層析純化蔗糖酶 三、蔗糖酶各級(jí)分活性及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)共有三個(gè)分實(shí)驗(yàn)： 細(xì)胞破壁的幾種方法 高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約 1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。 玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。 反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在 20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。 化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（ SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。 有機(jī)溶劑沉淀法：即向水溶液中加入一定量的親水性的有機(jī)溶劑可降低溶質(zhì)的溶解度使其沉淀被析出。 （一）蔗糖酶的提取與部分純化 （ 1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。 （ 2）稱取 2g干啤酒酵母，稱 10mg蝸牛酶及適量（約 4g）二氧化硅，放入研缽中。二氧化硅要預(yù)先研細(xì)。 （ 3）量取預(yù)冷的甲苯 12ml緩慢加入酵母中，邊加邊研磨成 糊狀 ，約需 60分鐘。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。 （ 4）緩慢加入預(yù)冷的 20ml去離子水，每次加 2ml左右，邊加邊研磨，至少用 30分鐘。以便將蔗糖酶充分轉(zhuǎn)入水相。 （ 5）將混合物轉(zhuǎn)入 1個(gè)離心管中，平衡后，用高速冷凍離心機(jī)離心， 4℃ ， 4700rpm， 15min。 如果中間白色的脂肪層厚，說(shuō)明研磨效果良好。用滴管吸出上層有機(jī)相。 操作步驟 （ 6）用滴管小心地取出脂肪層下面的水相，轉(zhuǎn)入另一個(gè)清潔的離心管中， 4℃ ， 4700rpm，離心
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