【正文】 第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶 切割 DNA DNA連接酶 生成 3’ 5’磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 Ⅰ 探針標(biāo)記、補(bǔ)平 3’末端 反轉(zhuǎn)錄酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5’磷酸化、探針標(biāo)記 末端轉(zhuǎn)移酶 3’末端多聚尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 常用的工具酶： 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 第二節(jié) DNA連接酶 第三節(jié) DNA聚合酶 第四節(jié) DNA及 RNA的修飾酶 第五節(jié) 核酸外切酶 第六節(jié) 單鏈核酸內(nèi)切酶 一、寄主控制的限制與修飾 二、 Ⅱ 型限制酶的特點(diǎn) 三、影響內(nèi)切酶活力的因素 四、核酸內(nèi)切酶對 DNA的消化作用 五、 限制酶的用途 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 與 DNA分子的體外切割 一 、 寄主控制的限制與修飾 ? 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙 。 即所謂的 寄主控制的 限制與修飾 現(xiàn)象簡稱 （ R/M體系 ） 。 ? 細(xì)菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng) ， 能辨別自身的 DNA與外來的 DNA， 并能使后者降解掉 。 ? 限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段 。 各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶 ， 它們以此來限制外源 DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi) ， 但合成這種酶的細(xì)胞自身的 DNA不受影響 ， 因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶 ， 對自身的 DNA進(jìn)行了修飾 ， 限制性酶對修飾過的 DNA不能起作用 。 修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 作 用： 保護(hù)自身 DNA不受限制； 破壞外源 DNA使之降解 ? B含有 EcoB核酸酶 和 EcoB甲基化酶 ? 當(dāng) λ(k)噬菌體侵染 ， 由于其 DNA中有 EcoB核酸酶特異識別的堿基序列 ， 被降解掉 。 而 B的 DNA中雖然也存在這種特異序列 ， 但可在 EcoB甲基化酶的作用下 ， 催化S腺苷甲硫氨酸 （ SAM） 將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基 ， 使之甲基化 。 EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列 。 數(shù)字表示在不同寄主中生長的噬菌體的成斑率 ，表示限制程度 。 二．限制和修飾作用的分子機(jī)制 1．大腸桿菌宿主細(xì)胞 K株， B 株 ，有各自的限制和修飾系統(tǒng)。 1） 它們均有三個(gè)連續(xù)的基因位點(diǎn)控制， hsdR。 hsdM。 hsdS. 2） hsdR編碼限制性核酸內(nèi)切酶 識別 DNA分子特定位點(diǎn)，將雙鏈 DNA切斷。（ DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)胞：受體細(xì)胞去掉 hsdR基因位點(diǎn)） 3） hsdM編碼產(chǎn)物是 DNA甲基化酶 催化 DNA分子特定位點(diǎn)的堿基甲基化反應(yīng)。 4） hsdS表達(dá)產(chǎn)物的功能是 協(xié)助限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點(diǎn)。 ? 限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源 DNA的一類酶 ， 其功能是避免外源DNA的干擾或噬菌體的感染 ， 是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制 。 由于 R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶 。 ? 根據(jù)酶的功能 、 大小和反應(yīng)條件 ， 及切割DNA的特點(diǎn) ， 可以將限制性內(nèi)切酶分為三類： Ⅰ 型酶 、 Ⅱ 型酶 、 Ⅲ 型酶 限制性內(nèi)切酶的類型 （ 1） Ⅰ 型酶： ? 1968年 ， M. Meselson和 R. Yuan在 E. coli B和E. coli K中分離出的核酸內(nèi)切酶 。 ? 分子量較大 ， 反應(yīng)需 Mg2+、 S腺苷酰 L甲硫氨酸 （ SAM） 、 ATP等 。 ? 這類酶有特異的識別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn) ， 而且切割是隨機(jī)的 ， 所以在基因工程中應(yīng)用不大 。 （ 2） Ⅱ 型酶 ? 1970年 ， 感嗜血菌 Rd株中分離出來的限制酶 。 ? 分子量較小 （ 105 Da） ， 只有一種多肽 ，通常以同源二聚體的形式存在 。 反應(yīng)只需 Mg2+的存在 ， 并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn) ， ? 識別位點(diǎn)是一個(gè) 回文對稱結(jié)構(gòu) ， 并且切割位點(diǎn)也在這一回文對稱結(jié)構(gòu)上 。 ? 許多 Ⅱ 型酶切割 DNA后 ， 可在 DNA上形成粘性末端 ， 有利于 DNA片段的重組 。 （ 3） Ⅲ 型酶 ? 這類酶可識別特定堿基順序 ， 并在這一順序的 3’端 24~26bp處切開 DNA， 所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的 。 二、限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn) 定義、命名 （ 1） 定義 ? 廣義指上述三個(gè)系統(tǒng)中的限制酶； 狹義指 II型限制酶 。 （ 2） 命名 ? 限制酶由三部分構(gòu)成 ， 即菌種名 、 菌系編號 、 分離順序 。 例 如 ： HindⅢ 前 三 個(gè) 字 母 來 自 于 菌 種 名 稱 H. influenzae， “ d”表示菌系為 d型血清型 （ 菌株號 ） ； “ Ⅲ ”表示分離到的第三個(gè)限制酶 。 EcoRI— Escherichia coli RI 限制酶的特點(diǎn) （ 1） 基本特點(diǎn) ? 在 DNA雙鏈的特異性識別序列部位 ， 切割DNA分子 ， 產(chǎn)生鏈的斷裂 。 ? 兩個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA分子上的分布 ， 通常不是彼此直接相對的 ? 因此 ， 斷裂的結(jié)果形成的 DNA片斷 ， 也往往具有 互補(bǔ)的單鏈延伸末端 。 （ 2） 識別順序和酶切位點(diǎn) ① 識別４ 8個(gè)相連的核苷酸 Mbo I NGATCN Ava II GG(A/T)CC BamH I GGATCC PpuM I PuGG(A/T)CCPy ? 估算 RE識別序列在 DNA上出現(xiàn)的頻率 : 識別序列的頻率 =1/4n Sau3A (4bp)=1/44 256bp EcoR I、 Pst I (6bp)=1/46 4096 Not I (8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 僅是理論推測 ② 對稱性 ③ 限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端，末端結(jié)構(gòu)是 5’P和 3’OH EcoRI 5’G A A T T C3’ 3’C T T A A G5’ （ 3）末端種類 ① 3’端突起，個(gè)數(shù)為 2或 4個(gè)核苷酸 ? Pst I 5’CTGCAG3’ 5’CTGCA G3’ 3’GACGTC5’ 3’G ACGTC5’ ② 5’ 端突起，個(gè)數(shù)為 2或 4個(gè)核苷酸 ? EcoRI 5’GAATTC3’ 5’G AATTC3’ 3’CTTAAG5’ 3’CTTAA G5’ ③ 平齊末端 ? SmaI 5’CCCGGG3’ 5’CCC GGG3’ 3’GGGCCC5’ 3’GGG CCC5’ ④ 非互補(bǔ)的粘性末端 ? 切點(diǎn)在識別順序之外的，如： FokI Fok I 5’GGATG(Ｎ )93’ 5’GGATG(N)9 3’CCTAC(Ｎ )135’ 3’CCTAC(N)13 ? 能識別簡并順序的，如： AvaI AvaI 5’CPyCGPuG3’ CCCGGG、 CTCGGG、 CCCGA、 CTCGAG 5’粘性末端 3’粘性末端 平頭末端 （ 4）異源同序酶（ isoschizomer，同裂酶） ① 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶 ② 特點(diǎn)： ? 識別相同順序 ? 切割形成相同的末端 KpnI GGTACC SstI CCGCGG Asp718 GGTACC SacI CCGCGG 例：限制酶 HpaII和 MspI共同的靶序列 CCGG （ 5）同尾酶（ isocaudamer） 例： BamHI和 BglⅡ BamHI G