臨檢培訓(xùn)基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用臨檢培訓(xùn)班(已修改)
2025-06-07 01:50 本頁面
【正文】 基因擴(kuò)增技術(shù)在遺傳病基因診斷中的應(yīng)用 劉敬忠 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 北京基因診斷實(shí)驗(yàn)室 北京朝陽醫(yī)院法醫(yī)物證司法鑒定所 中心法則 復(fù) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 DNA RNA 蛋白質(zhì) 蛋白 制 反轉(zhuǎn)錄 糖蛋白 脂蛋白 酶類 激素 細(xì)胞因子 基因重組技術(shù) 基因探針技術(shù) 基因重組藥物 基因診斷 基因治療 PKU 尿毒癥（口服 artificial cells) 基因診斷 運(yùn)用基因探針， PCR技術(shù)等探測(cè)特定靶基因的存在與否，或是否有基因突變等缺陷，從而對(duì)疾病或病原體感染作出診斷叫基因診斷。 基因型 表 型 基 臨 血 生 細(xì) 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 診 學(xué) 學(xué) 學(xué) 學(xué) 學(xué) 斷 診 診 診 診 診 診 斷 斷 斷 斷 斷 斷 基因診斷的特點(diǎn) 靈敏度高（早期） 特異性強(qiáng) 操作簡便 取材大多不受組織器官限制 可進(jìn)行早期診斷，癥狀前診斷及產(chǎn)前診斷 檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)病毒等微生物時(shí)不需培養(yǎng) 聚合酶鏈反應(yīng) Polymerase Chain Reaction（ PCR） Kary B. Mullis 1984 年問世 , 成為分子生物學(xué)和生命科學(xué)發(fā)展史上的里程碑 1993 榮獲諾貝爾獎(jiǎng) Mendocin 128號(hào)公路附近一棵七葉樹下的突發(fā)奇想 專利官司之戰(zhàn) : DuPont 與 Cetus對(duì)薄公堂 PCR 原理示意圖 PCR技術(shù)的應(yīng)用 一 、在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 二、遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷： 血友病、 地中海貧血、 DMD、 PKU等等 三、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體等 四、病毒 五、白血病、腫瘤 六、骨髓移植、器官移植供體配型選擇 七、法醫(yī)學(xué) 八、動(dòng)植物學(xué) 九、古人類學(xué)、古生物學(xué) PCR原理示意圖 熱變性：從外周血白細(xì)胞或絨毛、羊水細(xì)胞提取的 DNA約 1ug，在含有適當(dāng)緩沖液、引物、dNTPs（ dATP、 dCTP、 dGTP及 dTTP）等的反應(yīng)混合物中，在 94℃ 下熱變性 4分鐘，使之解為單鏈。 退火：然后臵反應(yīng)混合物于 55℃ ，使引物與解為單鏈的 DNA上互補(bǔ)序列雜交在一起，稱之為退火。并迅速加入 2單位耐熱的Taq DNA聚合酶，混勻、離心 10秒鐘。為防止在整個(gè) PCR過程中，水份的蒸發(fā)影響PCR效果，通常加入 35ul石蠟油封蓋液面。 引物延伸：臵上述反應(yīng)混合物于 70℃ 水浴中 12分鐘，在 DNA聚合酶催化作用下，以 dNTPs為原料（底物），從引物的 3’端 A開始 , 沿著 5’→ 3’的方向，合成每條模板的互補(bǔ)鏈，此稱引物延伸。結(jié)果， DNA拷貝數(shù)增加了一倍。 接著，將上述熱變性 — 退火 — 引物延伸（稱為一個(gè)循環(huán)）反復(fù)進(jìn)行 3035次。只是熱變性的時(shí)間縮短為 1分鐘左右。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)， DNA拷貝數(shù)便增加一倍（ 2）。因此，如進(jìn)行 n次循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加 2n倍！進(jìn)行 25個(gè)循環(huán)，則拷貝數(shù)將增加 225倍，即上百萬倍。在瓊脂糖凝膠電泳上可看到特異性長度的擴(kuò)增帶?？梢?PCR之所以高速擴(kuò)增的關(guān)鍵是因?yàn)槊看涡潞铣傻?DNA鏈在后來的循環(huán)中都可以作模板，猶如滾雪球，數(shù)量迅速增加。 如果引物 5’端有幾個(gè)與模板 DNA不配對(duì)的堿基，仍可能與模板 DNA退火、延伸，對(duì) PCR效果影響不大
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