基因工程在食品工業(yè)中的應用(已修改)
2025-01-28 15:14 本頁面
【正文】 第二章 基因工程原理及其在食品工業(yè)中的應用 第一節(jié) 基因工程基礎 （ 一 ） 基因工程的定義 （ gene） DNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列，是遺傳物質(zhì)最小功能單位。 （ geneome） 一個生物體的全部基因序列。 一 、 基因工程的定義 、 基本操作程序 （ gene expression） 遺傳信息轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。 （ 1）轉(zhuǎn)錄。在 DNA分子上合成出與其核苷酸順序相對應的 RNA的過程。 （ 2）翻譯。在 RNA的控制下，根據(jù)核苷酸鏈上每三個核苷酸決定一個氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈過程。 （ 3）逆轉(zhuǎn)錄。以 RNA為模板，按照 RNA中的核苷酸順序合成 DNA的過程。 DNA技術（ rebinant DNA technique） 利用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同的 DNA進行體外切割、連接構(gòu)成新的 DNA分子的技術。 （ gene engineering） 運用限制性內(nèi)切核酸酶、連接酶等酶類將不同 DNA進行體外切割、連接構(gòu)成重組 DNA，再將重組 DNA經(jīng)生物介導或直接導入等轉(zhuǎn)移方法引入受體細胞進行克隆、表達，從而改變生物遺傳性以創(chuàng)造生物新種質(zhì)，或通過大量擴增為人類提供有用產(chǎn)品等的技術。 利用基因工程的技術和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，以改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食品的營養(yǎng)價值、貯藏價格性狀以及感官性狀的技術。 （二）基因工程的基本操作程序 制備目的基因。 外連接，構(gòu)建重組 DNA。 DNA導入受體生物細胞以獲得轉(zhuǎn)化體。 。 析以及操作，使目的基因在受體生物細胞中高效表達。 （三）基因工程的三大理論和三大技術基礎 （ 1） 1940年代 Avery等人的肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗證明了生物的遺傳物質(zhì)是 DNA。 （ 2） 1950年代 Watson和 Crick發(fā)現(xiàn)了 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)及 DNA半保留復制機理。 （ 3） 1960年代 Crick關于遺傳中心法則的確立，即生物體中遺傳信息是按 DNA→RNA→ 蛋白質(zhì)方向進行傳遞。 （ 1）如何從生物體龐大的雙鏈 DNA分子中將所需要的基因片段切割下來（限制性內(nèi)切核酸酶）。 （ 2）如何將獲得的基因片段進行連接（ DNA連接酶）。 （ 3）如何將切割下來的基因片段進行繁殖擴增（基因載體）。 二、基因工程的工具酶 工具酶 ：基因工程的操作，是依賴于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、連接酶等）作為工具來對基因進行切割和拼接等操作，這些酶被稱為工具酶。 （一）限制性內(nèi)切核酸酶與 DNA甲基化酶 限制作用 （ restriction）：指一定類型的細菌可以通過其限制性內(nèi)切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源 DNA的入侵受到限制的現(xiàn)象。 修飾作用 （ modification）：指在 DNA甲基化酶作用下，生物體自身 DNA分子在 特定堿基 的特定位置上發(fā)生甲基化而得到修飾，從而免遭自身限制性內(nèi)切核酸酶降解的現(xiàn)象。 DNA甲基化酶 限制性內(nèi)切核酸酶 （ restriction endonuclease）：簡稱限制酶，指一類能夠識別和切割雙鏈 DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶。 DNA甲基化酶 （ DNA methylase）：簡稱甲基化酶，指一類能夠識別 DNA特定序列，并在其特定堿基的特定位置上引入甲基而發(fā)生修飾作用的酶。 （ 1） Ⅰ 型 。 由三種不同亞基組成；輔助因子為 ATP、Mg2+及 S腺苷甲硫氨酸；切割位點距其識別位點至少 1 000bp；切割作用隨機 。 Ⅰ 型限制酶不宜作為基因工程的工具酶 。 （ 2） Ⅱ 型 。由兩個相同亞基組成；輔助因子僅為 Mg2+；識別位點常具 旋轉(zhuǎn)對稱性 ；切割位點與其識別位點重疊或在其附近；切割作用特異性強。 Ⅱ 型限制酶是基因工程理想的工具酶 。 （ 3） Ⅲ 型 。 由兩種不同亞基組成；輔助因子為 ATP和Mg2+， 也受 S腺苷甲硫氨酸激活 ， 但并非必需；切割位點一般在距其識別位點 3’端 24～ 26bp處 。 Ⅲ 型限制酶在基因工程中也不常用 。 限制性內(nèi)切核酸酶沒有種屬特異性 ， 即限制性內(nèi)切核酸酶識別 、 切割特定序列的能力同底物 DNA的來源無關 ，它可識別 、 切割各種來源的 DNA。 DNA甲基化酶具有種屬特異性 ，生物體的 DNA甲基化酶只修飾保護自己的 DNA，而不修飾保護非己的 DNA。生物體的限制性內(nèi)切核酸酶不能降解自身被修飾保護的 DNA，而只能降解外源的 DNA。 表 41 限制性內(nèi)切核酸酶的類型及主要特性 主要特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 酶蛋白構(gòu)成 三種不同亞基 兩個相同亞基 兩種不同亞基 酶活輔助因子 ATP、 Mg2+及 S腺苷甲硫氨酸 Mg2+ ATP、 Mg2+ 識別序列特性 EcoB Ⅰ:TGAN 8TGCT EcoKⅠ:AACN 6GTGC 旋轉(zhuǎn)對稱 EcoP Ⅰ:AGACC EcoP15 Ⅰ:CAGCAG 切割位點 距其特異識別位點至少 1000bp處隨機切割 在特異切割位點上或其附近特異切割 距其識別位點 3’端24～ 26bp處 特異切割 4.Ⅱ 型限制性內(nèi)切核酸酶的切割方式 在識別序列雙鏈 DNA兩條鏈的對稱軸上同時切斷磷酸二酯鍵，形成 雙鏈平齊末端 。 在識別序列雙鏈 DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從 3’端切斷磷酸二酯鍵，形成 3’羥基 端 2～ 5個核苷酸突出 單鏈黏性末端 。 在識別序列雙鏈 DNA兩條鏈的對稱軸兩側(cè)同時從 5’端切斷磷酸二酯鍵，形成 5’磷酸 端 2～ 5個核苷酸突出 單鏈黏性末端 。 （ 1）底物 DNA制備物的純度 蛋白質(zhì)、十二烷基硫酸鈉（ SDS）、乙二胺四乙酸（ EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高濃度的鹽離子等污染物都會抑制限制酶的活性。 （ 2）底物 DNA的甲基化程度 dam甲基化酶 ：特異地催化 DNA分子中 5’GATC3’序列中的 腺嘌呤 N7位置的甲基化。 dcm甲基化酶 ：催化 DNA分子中 5’CCAGG3’或 5’CCTGG3’序列中的 胞嘧啶 C5位置的甲基化。 （ 3）底物 DNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)型 環(huán)狀雙螺旋 DNA較線性 DNA穩(wěn)定 。 在用限
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