【正文】 植 物細(xì)胞培養(yǎng)制藥 ?意義 藥用植物是天然藥物的寶庫 植物細(xì)胞培養(yǎng)是生產(chǎn)的藥物可能途徑 ?目前采用植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括 （ 1） 苷 （ 甙 ） 類：包括皂苷 （ 人參皂苷 、 三七皂苷 、 柴胡皂苷 、 著芋皂苷等 ） 、 強(qiáng)心苷 （ 強(qiáng)心醇苷 、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等 ） 、 甘草甜苷 、 香豆精苷等 。 （ 2） 甾醇：包括菜油甾醇 、 豆甾醇 、 谷甾醇 、 膽甾醇 、 異巖藻甾醇等 。 2 0 R 原 人 參 二 醇 R = H2 0 R 原 人 參 三 醇 R = ? O H2 0 S 原 人 參 三 醇 R = ? O H2 0 S 原 人 參 二 醇 R = HH OH O H O2 01 71 41 31 0HHHHH OH OR8H2 01 71 41 31 0HHHH OR8HRH O1 73強(qiáng)心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)） 甾醇 （ 3） 生物堿：吡啶 、 喹啉 、 異喹啉等 。 （ 4） 醌類：包括蒽醌 、 萘醌等 。 （ 5） 蛋白質(zhì)類：胰島素 、 氨基酸 、 蛋白酶抑制劑 。 植物病毒抑制劑 、 植物抗生素等 。 （ 6） 黃酮類：具有 C6C3C6結(jié)構(gòu) ， 生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶 A。 多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分 。 OOOOOOO HNO C H 3O C H 3OOO H+ 小檗堿 蒽醌 黃酮 植 物細(xì)胞培養(yǎng)制藥進(jìn)展 ? 第一個(gè)專利： 1956年 Routin和 Nickell首次數(shù)提出利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的第一個(gè)專利 ? 工業(yè)植物生物技術(shù) ： 20世紀(jì) 90年代明確提出 ? 已經(jīng)從 200余種藥用植物獲得了愈傷組織或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物（傅經(jīng)國等， 2022） – 國際 ? 日本 ：紫草 人參 紅豆杉 ? 歐美 ：美國－紅豆杉； 德國－ 紫錐菊 ?國內(nèi)：羅士韋 葉和春 鄭光植 侯嵩生 丁家宜 技術(shù)路線 ? 目標(biāo)植物選擇 – → 愈傷組織誘導(dǎo) →→ 液體培養(yǎng) →→ 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 →→ 反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng) – → 愈傷組織誘導(dǎo) →→ 固體 、 液體培養(yǎng) →→高產(chǎn)細(xì)胞系篩選 →→ 生物合成途徑的研究 – → 器官分化 （ 發(fā)狀根 ） →→ 固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化 →→ 反應(yīng)器擴(kuò)大培養(yǎng) →→ 有效成分提取 、 分離 植物細(xì)胞培養(yǎng) 是指在離體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細(xì)胞的一種技術(shù)。 植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) : ? ⑴ 大小 。 ? ⑵ 細(xì)胞團(tuán)的形式存在 。 ? ⑶ 纖維素細(xì)胞壁和大液泡 ,易被剪切力損傷 。 ? ⑷ 生長緩慢 ? ⑸培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜 ,易被微生物污染 。 ? ⑹ 需光 \氧 \二氧化碳 培養(yǎng)類型 ? 按培養(yǎng)對(duì)象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)； ? 按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)； ? 按培養(yǎng)方式可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng) 。 植物單細(xì)胞分離和初步培養(yǎng) ? 單細(xì)胞獲得： ? 機(jī)械法；酶解法；愈傷組織法 ? 單細(xì)胞培養(yǎng)： ? 看護(hù)培養(yǎng)法（ nursing culture) ? 飼養(yǎng)層培養(yǎng) (feeding layer culture) 固體培養(yǎng) ? 固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝人培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。 ? 優(yōu)缺點(diǎn) – 簡(jiǎn)便易行、所占空間小 – 生長的不平衡，易出現(xiàn)了極化現(xiàn)象 – 易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì) – 有些生理生化指標(biāo)測(cè)定不方便 ? 常用的固化劑 – 瓊脂、明膠（ 10%）等 液體培養(yǎng) 1．成批培養(yǎng)法 batch culture – 細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng) ,在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變 ,不添加營養(yǎng)成分 ,待細(xì)胞增長和產(chǎn)物積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 ,一次性收獲細(xì)胞 \產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法 . 液體培養(yǎng) 1．成批培養(yǎng)法 batch culture ?特點(diǎn)： – 操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)周期短 . – 直接反映細(xì)胞生長代謝過程 . – 可直接放大 – 不能控制底物濃度 \細(xì)胞易老化 \生長周期短 \效率低 . ? 兩步 成批培養(yǎng)法 – 即使用兩個(gè)生物反應(yīng)器，第一個(gè)反應(yīng)器用于細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)反應(yīng)器用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。 2. 半連續(xù)培養(yǎng)法 semicontinuous culture – 重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng) .在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中 ,每間隔一段時(shí)間從中取出部分培養(yǎng)液或細(xì)胞 ,剩余的細(xì)胞作為種子 ,再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原體積 ,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變 . – 特點(diǎn) : – 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長 ,并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平 ,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時(shí)間 . – 可進(jìn)行多次收獲 . – 操作簡(jiǎn)便 ,生產(chǎn)效率高 . 3．連續(xù)培養(yǎng)法 (continuous culture) ? 連續(xù)培養(yǎng)法是利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器 ， 在投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后 ， 以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞和培養(yǎng)液 ， 并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法 。 ? 該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù) Monod公式 ， 即生長速度取決于基質(zhì)的濃度 。 181。＝ 181。max S/(Ks+S) 181。 =特定生長速度； 181。max=特定最大生長速度； Ks=飽和系數(shù)； S=基質(zhì)濃度 ? 兩階段連續(xù)培養(yǎng)法 – 于第一反應(yīng)器中投入生長培養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。 3．連續(xù)培養(yǎng)法 (continuous culture) ?特點(diǎn) : ?細(xì)胞能在近似恒定狀態(tài)下生長 、 營養(yǎng)物質(zhì)濃度 、 產(chǎn)物濃度 、 pH基本保持恒定 ， 細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長速率可基本維持不變 ， 細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長 。 ?穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長期 。 3．連續(xù)培養(yǎng)法 (continuous culture) ?問題 : ?一直有細(xì)胞收獲 ， 濃度一般不高 ?細(xì)胞分裂快 、 易變異； ?由于是開放式操作 ， 加上培養(yǎng)周期較長 ， 容易造成污染 ?對(duì)設(shè)備 、 儀器的控制技術(shù)要求較高 。 懸浮培養(yǎng) （ Suspension culture） ? 懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 ? 特點(diǎn) 1. 培養(yǎng)細(xì)胞可不斷增殖，且生長速度快。 2. 液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對(duì)保持一致。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立 愈傷組織的誘導(dǎo) 懸浮系的建立與繼代培養(yǎng) 懸浮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài) 懸浮細(xì)胞同步化 愈傷組織的誘導(dǎo) ? 選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。 ? 選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的附加物質(zhì)。 ? 要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎 懸浮系的建立與培養(yǎng) callus 150~250ml flask centrifuge isolation subculture 1g/10ml medium 100~120 rmp culture transfer 1 time/3d 80 rpm 成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系特征 ? 懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在 30～ 50個(gè)細(xì)胞以下。 ? 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 ? 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般 2～3天便可增加一倍。 懸浮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài) 懸浮細(xì)胞生長的衡量 ? 根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞質(zhì)量變化。 ? 生長速率 (p)：不同時(shí)間細(xì)胞密度 (x)的自然對(duì)數(shù)與起始密度 (x0)的自然對(duì)數(shù)之差與培養(yǎng)時(shí)間 (