《植物細(xì)胞培養(yǎng)制藥》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 加入前體物質(zhì)有利于細(xì)胞的生長和黃酮合成。 –選擇 ? 對某一目的產(chǎn)物來講可能有多種前體物質(zhì) ? 同一種前體物質(zhì)又可能有多條代謝路徑從而形成不同的代謝產(chǎn)物。 紫草素－－肝膽疾病輔助用藥 ? 甘煩遠(yuǎn)等（ 1997）研究表明，云南紅豆杉懸浮細(xì)胞適宜的培養(yǎng)基為 B5，當(dāng)添加椰子汁(CM)、酪蛋白氨基酸 (CA)和水解乳蛋白 (LH)3種有機(jī)物時(shí)，均能提高培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇的含量，而且 CM和 CA還能促進(jìn)細(xì)胞的生長。 BA好于 2,4D。 規(guī)?；囵B(yǎng)中有關(guān)工程技術(shù)問題 ? CO2調(diào)節(jié) ? 在通氣過程中，混入 2％～ 4％的 CO2能消除高通氣速率對長春花細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物合成的不利影響。 –在相同物質(zhì)濃度下 , 大細(xì)胞團(tuán)的營養(yǎng)液表觀粘度明顯大于小細(xì)胞團(tuán)的表觀粘度。 –抗剪切能力弱。 ? Alfermann等 (1983)用氣升式系統(tǒng)，采用海藻鈣固定細(xì)胞成功地用 30 L和 200 L的反應(yīng)器生產(chǎn)地高辛。 –細(xì)胞位置的固定使其所處環(huán)境類似于在植物體中所處的狀態(tài)，相互間接觸密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物合成。 ? 攪拌式 ? 氣動(dòng)式 ? 固定化式 ? 其它 — 光照生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)鼓式 反應(yīng)器類型 體積（ L） 培養(yǎng)植物種類 攪拌式 7， 15 D. carota 胡蘿卜 攪拌式 20， 15500 N. tabacum 煙草 攪拌式 5000 C. roseus 長春花 螺旋攪拌式 20 C. blumei 五彩蘇 提升攪拌式 P. elliotii 濕地松 鼓泡式 20， 30， 130 P .ginseng 人參 鼓泡式 65， 1500 N. tabacum 煙草 外環(huán)氣升式 10， 30， 85 C. roseus 長春花 導(dǎo)筒氣升式 20， 210 狹葉毛地黃 轉(zhuǎn)鼓式 1－ 4 長春花 植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器 攪拌式反應(yīng)器 ? 是根據(jù)植物細(xì)胞特性在微生物發(fā)酵罐基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。 ? 培養(yǎng)方式的選擇 –根據(jù)次生產(chǎn)物積累而定，通常還根據(jù)不同要求進(jìn)行改進(jìn)。 –細(xì)胞生長速度快，短時(shí)間內(nèi)能生產(chǎn)較多產(chǎn)物 –產(chǎn)物不被迅速降解，最好能分泌到培養(yǎng)基中 植物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立 ? 種子細(xì)胞選擇 ? 種子細(xì)胞增殖與放大培養(yǎng) ? 大規(guī)模培養(yǎng)體系建立 種子細(xì)胞選擇 ? 外植體選擇 –植物類型：遺傳基礎(chǔ)。 – 首先 ， 固定化培養(yǎng)要求代謝產(chǎn)物必須是分泌到細(xì)胞外的 。 雙層濾紙植板培養(yǎng) ?Horsch等（1980）建立 培養(yǎng)皿 培養(yǎng)基 飼養(yǎng)細(xì)胞層 培養(yǎng)細(xì)胞 看護(hù)濾紙 轉(zhuǎn)移濾紙 固定化培養(yǎng)法 ? 將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細(xì)胞固定化培養(yǎng)。 微室培養(yǎng) (microchamber culture) ? 在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。 ? 缺點(diǎn)：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。 細(xì)胞平板培養(yǎng)（ plating culture) ? 平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。 ? 酶解法的優(yōu)點(diǎn) –可獲得較多的葉肉游離細(xì)胞（但對禾本科植物葉片效果不好）。 –梅興國等（ 2022）采用 6℃ 低溫處理紅豆杉細(xì)胞也獲得較明顯同步化效果。 –常用抑制劑主要有 5氟脫氧尿苷 (FudR)和羥基尿 (HU)。因此，通過饑餓法可以獲得處于 G1和 G2期的同步化細(xì)胞。 ? 植物細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中容易團(tuán)聚并進(jìn)入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達(dá)到完全同步化是十分困難的。 影響懸浮細(xì)胞生長的因素 ? 培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動(dòng)式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng) ? 溫度 25℃ ? 繼代周期 – 指具有一定起始密度的細(xì)胞 ,從開始培養(yǎng)到細(xì)胞數(shù)目和總重量增長停止的一個(gè)過程。 影響懸浮細(xì)胞生長的因素 ? 培養(yǎng)基 –應(yīng)用 條件培養(yǎng)基 （生長過愈傷組織或懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基）提供單細(xì)胞生長和分裂所需的特殊代謝物。 ? 生長速率 (p)：不同時(shí)間細(xì)胞密度 (x)的自然對數(shù)與起始密度 (x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時(shí)間 (t)的比值 p＝ (lnxlnx0)/t ? 鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細(xì)胞生長情況 ? 干重：鮮細(xì)胞烘干至衡重，反應(yīng)細(xì)胞質(zhì)量 影響懸浮細(xì)胞生長的因素 ? 起始愈傷組織的質(zhì)量 ? 接種細(xì)胞密度：懸浮細(xì)胞的起始密度一般在 ~ 105個(gè)細(xì)胞 /毫升。 ? 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的建立 愈傷組織的誘導(dǎo) 懸浮系的建立與繼代培養(yǎng) 懸浮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài) 懸浮細(xì)胞同步化 愈傷組織的誘導(dǎo) ? 選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。 3．連續(xù)培養(yǎng)法 (continuous culture) ?問題 : ?一直有細(xì)胞收獲 ， 濃度一般不高 ?細(xì)胞分裂快 、 易變異； ?由于是開放式操作 ， 加上培養(yǎng)周期較長 ， 容易造成污染 ?對設(shè)備 、 儀器的控制技術(shù)要求較高 。 =特定生長速度； 181。 181。 植物單細(xì)胞分離和初步培養(yǎng) ? 單細(xì)胞獲得： ? 機(jī)械法；酶解法；愈傷組織法 ? 單細(xì)胞培養(yǎng)： ? 看護(hù)培養(yǎng)法（ nursing culture) ? 飼養(yǎng)層培養(yǎng) (feeding layer culture) 固體培養(yǎng) ? 固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝人培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。 ? ⑵ 細(xì)胞團(tuán)的形式存在 。 （ 6） 黃酮類：具有 C6C3C6結(jié)構(gòu) ， 生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶 A。 2 0 R 原 人 參 二 醇 R = H2 0 R 原 人 參 三 醇 R = ? O H2 0 S 原 人 參 三 醇 R = ? O H2 0 S 原 人 參 二 醇 R = HH OH O H O2 01 71 41 31 0HHHHH OH OR8H2 01 71 41 31 0HHHH OR8HRH O1 73強(qiáng)心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)） 甾醇 （ 3） 生物堿：吡啶 、 喹啉 、 異喹啉等 。 （ 2） 甾醇：包括菜油甾醇 、 豆甾醇 、 谷甾醇 、 膽甾醇 、 異巖藻甾醇等 。 植物病毒抑制劑 、 植物抗生素等 。 植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn) : ? ⑴ 大小 。 ? ⑹ 需光 \氧 \二氧化碳 培養(yǎng)類型 ? 按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細(xì)胞培養(yǎng)； ? 按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)； ? 按培養(yǎng)方式可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng) 。 ? 該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù) Monod公式 ， 即生長速度取決于基質(zhì)的濃度 。 S/(Ks+S) 181。 ?穩(wěn)定狀態(tài)可有效地延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期 。 2. 液體狀態(tài)下便于細(xì)胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細(xì)胞狀態(tài)可以相對保持一致。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎 懸浮系的建立與培養(yǎng) callus 150~250ml flask centrifuge isolation subculture 1g/10ml medium 100~120 rmp culture transfer 1 time/3d 80 rpm 成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系特征 ? 懸浮培養(yǎng)分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在 30～ 50個(gè)細(xì)胞以下。 懸浮細(xì)胞的生長動(dòng)態(tài) 懸浮細(xì)胞生長的衡量 ? 根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞數(shù)變化，或細(xì)胞質(zhì)量變化。 ? 培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。 –植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化 ? 細(xì)胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 什么措施？ ?細(xì)胞周期 饑餓法 ? 饑餓導(dǎo)致的細(xì)胞分裂受阻常常是使細(xì)胞不能合成 DNA，即不能進(jìn)入 S期，或細(xì)胞分裂不能進(jìn)行，即不能進(jìn)入 M期。 抑制劑法 ? 通過一些 DNA合成
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