【正文】 DNA分析技術(shù)在法醫(yī)物證學(xué)上的應(yīng)用 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系 李莉 法醫(yī)物證學(xué)內(nèi)容 ?親權(quán)關(guān)系鑒定 ?個(gè)體識(shí)別 親權(quán)關(guān)系鑒定 ?親權(quán)糾紛（離婚案） ?移民案 ?強(qiáng)奸致孕案 ?拐賣丟失兒童案 ?（醫(yī)院中）嬰兒錯(cuò)抱案 ?（計(jì)劃生育中）超生與否的鑒定 個(gè)體識(shí)別 ?兇殺案 ?強(qiáng)奸案 ?碎尸案 ?石蠟包埋組織塊調(diào)錯(cuò)案 法醫(yī)物證學(xué)鑒定方法 ? 血清學(xué)方法 檢驗(yàn)紅細(xì)胞血型、白細(xì)胞血型、紅細(xì)胞酶型、血清型 ? DNA檢驗(yàn)技術(shù) DNA指紋技術(shù)、 PCR擴(kuò)增技術(shù) 血清學(xué)方法的局限性 ?檢材需要量大，且對時(shí)限要求較高 （ HLA分型要求采血后 1624小時(shí)內(nèi)必須檢驗(yàn)） ?不適用于陳舊、微量檢材 ?鑒別能力有限，不宜用于同一認(rèn)定 只能否定 DNA檢驗(yàn) DNA ? 核 DNA ? 線粒體 DNA 基因組 DNA: 核 DNA與線粒體 DNA Nucleus Mitochondria 基因組 穩(wěn)定的體系 人類基因組是一個(gè)十分穩(wěn)定的體系： ?不同的民族、群體和個(gè)體都有 46條染色體 ?有相同數(shù)目的基因 ?有基本相同的核苷酸序列 ?正是基因組結(jié)構(gòu)的這種穩(wěn)定性保證了人類作為一個(gè)物種的共同性和穩(wěn)定性。 基因組 變異的體系 ?人類基因組又是一個(gè)變異的體系。在長期進(jìn)化的過程中，基因組的 DNA序列不斷地發(fā)生變異。 ?這些變異可能是有害的、有益的或中性的。 ?其中一些變異得以遺傳，導(dǎo)致了不同種族、群體和個(gè)體間基因組的差異或多態(tài)性。 除了同卵雙生子外，沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組完全相同。 人類基因組計(jì)劃的成果 HGP： 19902022年 （中國參與了其中 1%的測序工作） ?解讀了人類 24條染色體上的 30億對堿基（ 3 109bp），繪制了人基因組草圖。 ?人基因組 DNA： 5%為基因編碼序列 ,95%為非編碼序列 ? 基因數(shù)量 :810萬 ? 不同個(gè)體間 % DNA序列完全相同 ? %DNA序列上的不同決定了個(gè)體間表型差異 ? DNA序列變異中的 90%表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性（ SNP） 單倍型圖譜計(jì)劃 ? HapMap計(jì)劃：找出約 50萬個(gè)標(biāo)簽 SNPs，提供與 1000萬個(gè) SNPs大致相同的圖譜信息。 ? HapMap計(jì)劃 :由日本、英國、加拿大、中國、尼日利亞和美國的科學(xué)家們合作完成。 2022年 10月正式啟動(dòng) ,歷時(shí)三年。 ? 2022年，中國承擔(dān)了“ HapMap 計(jì)劃” 10% 的任務(wù)。 HapMap“ 中國卷”的具體內(nèi)容 : 構(gòu)建人 3號(hào)、 21號(hào)染色體和 8號(hào)染色體短臂的 HapMap。 提供一半的亞洲樣品。 法醫(yī)學(xué) DNA檢測技術(shù)的發(fā)展 ?第一代： VNTR（小衛(wèi)星）檢測 （ DNA指紋技術(shù)） ?第二代： STR （微衛(wèi)星）檢測、線粒體 DNA檢測 （ PCR技術(shù)） 第三代： SNP（單核苷酸多態(tài)性）檢測 ?第一代： VNTR（小衛(wèi)星）檢測 （ DNA指紋技術(shù)， RFLP） （ 20世紀(jì) 80年代） RFLP技術(shù) DNA指紋技術(shù)的發(fā)明者 Jeffreys,遺傳學(xué)家 ,1985年 ? DNA指紋 ? DNA紋印 DNA指紋 ?使用一個(gè)含有多拷貝數(shù)核心序列的 多基因座 DNA探針 （如 ），在 低強(qiáng)度條件 下（較低溫度、較高鹽濃度）同時(shí)與許多 VNTR基因座（約 1000個(gè)） 雜交 ，經(jīng)電泳顯示其中 50100個(gè)基因座的雜交結(jié)果，獲得由一系列 DNA片段譜帶組成的圖像，稱 DNA指紋。 可進(jìn)行同一認(rèn)定 DNA紋印 ?使用 基因座特異性探針 ，在 高強(qiáng)度條件下（較高溫度、較低鹽濃度）與特定的基因座進(jìn)行 雜交 ，獲得 DNA紋印。雜合子顯示 2條譜帶，純合子顯示 1條譜帶。 DNA紋印 特異性強(qiáng)， 46個(gè)單基因座探針可達(dá)到同一認(rèn)定的目的。 操 作 流 程 限制酶 操 作 流 程 限制酶 DNA指紋技術(shù)應(yīng)用的實(shí)例 ?DNA應(yīng)用于親權(quán)鑒定的第一個(gè)案例 用 DNA指紋技術(shù)進(jìn)行一例移民案件的親權(quán)鑒定，使得一名 13歲的英國男孩得以回國與母親團(tuán)聚。 第二代： STR （微衛(wèi)星）檢測 （ PCR技術(shù)） 線粒體 DNA檢測（ PCR+測序） 20世紀(jì) 90年代：在法醫(yī)生物學(xué)方面，開始運(yùn)用 PCR技術(shù)檢測 VNTR、 STR、 mtDNA標(biāo)志，用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。 Polymerase Chain Reaction 1985年，由 Cetus公司的 Mullis博士發(fā)明 Nobel Prize 1993 ?Dr. Kary Mullis, was awarded a Nobel Prize for his work in 1993. DNA檢測方法比較 ? RFLP ?信息量大 ?費(fèi)時(shí)（ 1~2周） ?費(fèi)力 ? 50 ng DNA ?DNA 不能降解 ? PCR ?快速 ?省力 ?1 ng DNA ?適用于降解 DNA ?復(fù)合擴(kuò)增檢測 ?自動(dòng)化 mtDNA 結(jié)構(gòu) Dloop D環(huán)區(qū) （ displacement loop) 在線粒體DNA基因組中 占 57% 長約 1100bp HV1: 29408bp HV2: 1599616401bp mt DNA測序 ? DNA抽提； ? 利用兩對 引物，分別對 HVⅠ 、 HVⅡ 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增； ?PCR產(chǎn)物純化； ? 利用 HVⅠ 的 L鏈引物和 HVⅡ 的 L鏈引物，分別對 HVⅠ 、 HVⅡ的單鏈進(jìn)行 PCR擴(kuò)增（ dNTP帶有四色熒光標(biāo)記）； ? 乙醇沉淀 DNA； ? 在測序儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，判讀序列； ? 與 Anderson標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對，找出變異點(diǎn)。 母 系 遺 傳 mt DNA 毛發(fā) 骨骼 牙齒 俄沙皇 Nicholas II墓穴中的骨骸 （近 1000塊骨頭） ?沙皇（ Nicholas II） ?皇后（ Alexandra） ?3個(gè)女兒 ?1名家庭醫(yī)生 ?3名仆人 （ → 1991） ?一名公主失蹤 ?王子（ Alexis）死于 1977年 6月 26日 Nicholas II墓穴中的骨骸鑒定 ?皇后（ Alexandra） 皇后的妹妹 ↓外孫 Philip親王 (愛丁堡公爵 ) ?沙皇（ Nicholas II） 沙皇妹妹的女系后裔 ?mtDNA 存在異質(zhì)性 ?mtDNA 信息量有限 ?mtDNA呈母系遺傳特征 ?在法醫(yī)學(xué)上， mtDNA檢測不是主要的檢測手段。 細(xì)胞 細(xì)胞核 核 D N A 核 DNA的片段長度多態(tài)性 ?VNTR基因座（小衛(wèi)星） 重復(fù)單位 17170bp ?STR基因座（微衛(wèi)星） 重復(fù)單位 27bp 長度相差 1個(gè)重復(fù)單位就構(gòu)成一個(gè)等位基因 串聯(lián)重復(fù)序列 ? 多個(gè)特定序列首尾相連而成 (衛(wèi)星 DNA) ?在人類基因組中占 1520% 5 6 可變串聯(lián)重復(fù)數(shù)目 4 1 2 3 4 1 2 3 串聯(lián)重復(fù)序列的 遺傳多態(tài)性 ?串聯(lián)重復(fù)序列，如小衛(wèi)星 DNA (VNTR) 和微衛(wèi)星(STR) DNA，多態(tài)性表現(xiàn)為核心單元重復(fù)次數(shù)的不同。 (D13S317) ACGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGACAGAT ?微衛(wèi)星 DNA基因座在人類基因組中分布廣泛，是很好的遺傳標(biāo)記。 ?當(dāng)前， STR作為主要的遺傳學(xué)標(biāo)記物，用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。 Short Tandem Repeats ? 27 bp核心序列的串聯(lián)重復(fù) ? 300,000 個(gè) ? 每 10 kb存在一個(gè) STR基因座 ?擴(kuò)增片段為 10040