【正文】 2022/5/30 1 第七章 發(fā)酵過(guò)程的代謝控制 發(fā)酵過(guò)程控制是發(fā)酵的重要部分 控制難點(diǎn)：過(guò)程的不確定性和參數(shù)的非線性 同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會(huì)得到不同的結(jié)果，可見(jiàn)發(fā)酵過(guò)程的影響因素是復(fù)雜的，比如設(shè)備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時(shí)間的長(zhǎng)短，發(fā)酵過(guò)程的細(xì)微差別都會(huì)引起微生物代謝的不同。了解和掌握分析發(fā)酵過(guò)程的一般方法對(duì)于控制代謝是十分必要的 2022/5/30 2 第七章 發(fā)酵過(guò)程的代謝控制 第一節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化 第二節(jié) 發(fā)酵過(guò)程工藝控制的目的、研究的方法和層次 第三節(jié) 發(fā)酵過(guò)程的中間分析 2022/5/30 3 第一節(jié) 發(fā)酵過(guò)程中的代謝變化 初級(jí)代謝的代謝變化 次級(jí)代謝的代謝變化 2022/5/30 4 初級(jí)代謝的代謝變化 眾所周知，初級(jí)代謝是生物細(xì)胞在生命活動(dòng)過(guò)程中所進(jìn)行的代謝活動(dòng)，其產(chǎn)物即為初級(jí)代謝產(chǎn)物。 發(fā)酵中的菌體、基質(zhì)和產(chǎn)物三者變化的基本過(guò)程是：菌體進(jìn)入發(fā)酵罐后就開(kāi)始生長(zhǎng)、繁殖，直達(dá)一定的菌體濃度。 其生長(zhǎng)過(guò)程仍顯示適應(yīng) (停滯 )期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、靜止 (穩(wěn)定 )期和衰亡期等生長(zhǎng)史的特征。 但在發(fā)酵過(guò)程中，即使同一菌種，由于菌體的生理狀態(tài)與培養(yǎng)條件的不同，各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)短也不盡相同。如適應(yīng)期的長(zhǎng)短就隨培養(yǎng)條件而有所不同，并與接種菌的生理狀態(tài)有關(guān)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種移植到與原培養(yǎng)基組成完全相同的新培養(yǎng)基中，就不會(huì)出現(xiàn)適應(yīng)期，仍以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的方式繼續(xù)繁殖下去。 2022/5/30 5 初級(jí)代謝的代謝變化 另外，用靜止期以后的菌體接種，即使接種的菌體全部能夠生長(zhǎng)，也要出現(xiàn)適應(yīng)期。 因此， 工業(yè)發(fā)酵中往往要接入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (特別是中期 )的菌體，以盡量縮短適應(yīng)期。 為了獲得代謝產(chǎn)物，菌體尚未達(dá)到衰退期即行 放罐處理。 由于菌體生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物的形成， 基質(zhì) (如葡萄糖 )濃度的變化 一般是隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降， 溶解氧濃度 也隨發(fā)酵過(guò)程變化而發(fā)生變化。 初級(jí)代謝產(chǎn)物由于沒(méi)有明顯的產(chǎn)物形成期，所以它是隨菌體生長(zhǎng)在不斷地進(jìn)行的，有的與菌體生長(zhǎng)成平行關(guān)系，如乳酸、醋酸、氨基酸和核酸等。 2022/5/30 6 初級(jí)代謝的代謝變化 2022/5/30 7 初級(jí)代謝的代謝變化 上圖表示初級(jí)代謝產(chǎn)物谷氨酸發(fā)酵過(guò)程的代謝變化。 變化的根本原因在于菌體的代謝活動(dòng)引起環(huán)境的變化，而環(huán)境的變化又反過(guò)來(lái)影響菌體的代謝。 在 發(fā)酵初期 種子剛接入發(fā)酵罐中，菌體處于適應(yīng)期，以適應(yīng)新的環(huán)境。細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用，利用貯存物質(zhì)合成大分子物質(zhì)和所需的能量，菌體個(gè)體長(zhǎng)大，但沒(méi)有分裂，此時(shí) 糖等基質(zhì)基本不消耗或很少消耗， pH值 稍有上升是尿素被分解放出氨所致。 2022/5/30 8 初級(jí)代謝的代謝變化 菌體經(jīng)過(guò)適應(yīng)期之后就開(kāi)始繁殖，并很快進(jìn)入 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ，代謝逐漸旺盛，菌體大量繁殖，個(gè)體生長(zhǎng)和群體繁殖循環(huán)交替進(jìn)行， 培養(yǎng)物的混濁度 (以光密度表示 )與菌體增殖情況基本一致 ， OD(光密度 )直線增長(zhǎng)，菌體形態(tài)與二級(jí)種子相同。 耗糖 速度加快，糖作為碳源和能源用于合成細(xì)胞成分和合成反應(yīng)所需要的能量。 尿素被脲酶分解放出氨使 pH值 上升，氨被菌體利用可使 pH值下降，這時(shí)需及時(shí)補(bǔ)加尿素，補(bǔ)充氮源和調(diào)節(jié) pH值。 2022/5/30 9 初級(jí)代謝的代謝變化 由于菌體代謝活動(dòng)放出熱， 溫度 開(kāi)始上升。一般發(fā)酵 5h左右溫度上升，應(yīng)注意降溫。 由于菌體不斷增加，代謝旺盛，產(chǎn)生 CO2， 排氣中CO2濃度 顯著增加。 耗氧量 很快增加，培養(yǎng)基中的溶解氧下降，排氣中的 O2濃度也下降，應(yīng)根據(jù)情況提高風(fēng)量。特別是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期。應(yīng) 注意風(fēng)量 ，促進(jìn)菌體轉(zhuǎn)化。此時(shí)為長(zhǎng)菌階段，極少產(chǎn)谷氨酸，控制發(fā)酵條件以有利于長(zhǎng)菌。但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期要加大風(fēng)量，供給充足的氧，并及時(shí)流加尿素，供給充分的氮源，促進(jìn)增殖型菌體向生產(chǎn)型菌體轉(zhuǎn)化。 2022/5/30 10 初級(jí)代謝的代謝變化 在 生物素限量 的情況下，部分菌體內(nèi)的生物素含量由 “ 豐富轉(zhuǎn)向貧乏 ” ，此部分菌就停止繁殖，在條件適宜時(shí)，開(kāi)始伸長(zhǎng)、膨脹，形成生產(chǎn)型細(xì)胞 ，開(kāi)始 積累谷氨酸 。但是出于菌體增殖并非完全同步，還有部分菌體為增殖型， 這是菌體由增殖型向生產(chǎn)型轉(zhuǎn)化的時(shí)期，約需 10—18h。 在此期間，菌體數(shù)量達(dá)到最大值，培養(yǎng)液的 OD值與菌體增殖不一致，OD值除反映菌體增殖外，還反映了菌體的伸長(zhǎng)、膨大。 2022/5/30 11 初級(jí)代謝的代謝變化 這是代謝最旺盛的時(shí)期，耗糖加快，谷氨酸生成迅速增加，耗氧速率加快，并接近最大值。發(fā)酵控制方面必須 充分供氧 ，風(fēng)量達(dá)最大值，充分供給氮源。對(duì)發(fā)酵控制來(lái)講，此時(shí)以前的控制是 發(fā)酵成敗的關(guān)鍵 。此時(shí)期的變化受生物素和風(fēng)量的明顯影響。一般來(lái)說(shuō)，加大風(fēng)量對(duì)菌體的伸長(zhǎng)、膨大有促進(jìn)作用，菌體完成由增殖型向生產(chǎn)型轉(zhuǎn)化后，菌形幾乎都伸長(zhǎng)、膨大、邊緣不整齊、像花生型。 2022/5/30 12 初級(jí)代謝的代謝變化 大量積累谷氨酸，耗糖與產(chǎn)酸相適應(yīng)，產(chǎn)酸達(dá)最大值，對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率達(dá) 50％一 56％，應(yīng)繼續(xù)流加尿素，保證充足的氮源， pH值維持。為加快產(chǎn)酸速度適當(dāng)提高溫度，一般為 3637℃ 。根據(jù)菌體耗氧速率繼續(xù)供氧。 隨著發(fā)酵的延長(zhǎng)，糖已耗盡，產(chǎn)酸增加，菌體活力逐漸降低。 發(fā)酵后期 耗氧減少，可適當(dāng)降低風(fēng)量。流加尿素以少量為好，控制 pH＝ 。當(dāng)殘?zhí)墙档?1％，根據(jù)發(fā)酵情況可將風(fēng)量降到最低，促進(jìn)中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)向谷氨酸。 2022/5/30 13 次級(jí)代謝的代謝變化 次級(jí)代謝產(chǎn)物包括大多數(shù)的抗生素、生物堿和微生物毒素等物質(zhì)。按動(dòng)力學(xué)模型分類，它們的發(fā)酵屬于 菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)物非偶聯(lián)的類型 ，也就是說(shuō)，菌體生長(zhǎng)繁殖階段 (又稱生長(zhǎng)期 )與產(chǎn)物形成階段 (又稱生產(chǎn)期 )是分開(kāi)的。 次級(jí)代謝的代謝變化 (以抗生素發(fā)酵為代表 )如圖所示，一般分為 菌體生長(zhǎng) 、 產(chǎn)物合成 和菌體自溶 三個(gè)階段。 2022/5/30 14 菌體生長(zhǎng)階段 產(chǎn)生菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基后，在合適的培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的適應(yīng)就開(kāi)始生長(zhǎng)和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。 其代謝變化主要是，碳源 (包括糖類、脂肪等 )和氮源等進(jìn)行 分解代謝 ，菌體進(jìn)行 合成代謝 ，結(jié)果碳源、氮源和磷酸鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，濃度明顯減少，而新菌體不斷被合成、菌濃明顯增加。 隨著菌濃下斷增加， 攝氧率 也不斷增大，溶氧濃度不斷下降。當(dāng)菌濃達(dá)到臨界值時(shí)，溶氧濃度降至最小。 2022/5/30 15 菌體生長(zhǎng)階段 由于基質(zhì)的代謝變化， pH值 也發(fā)生一定改變， 有時(shí) 先開(kāi)始下降，而后上升 ，這是糖代謝先產(chǎn)生酮酸等有機(jī)酸而后被利用的結(jié)果； 有時(shí) 先開(kāi)始上升而后下降 ，這是菌體先以培養(yǎng)基中的氨基酸作為碳源而被利用，釋放出氨，使 pH值上升，而后氨又被利用使 pH值下降的結(jié)果。 2022/5/30 16 菌體生長(zhǎng)階段 當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗到一定程度，或者菌體達(dá)到一定濃度，或者供氧受到限制而使溶解氧濃度降到一定水平時(shí)，其中某一參數(shù)可能成為 菌體生長(zhǎng)的限制性因素 ，使菌體生長(zhǎng)速率減慢。 同時(shí)，在大量合成菌體期間，積累了相當(dāng)量的某些代謝中間體，原有酶的活力下降 (或消失 )，出現(xiàn)了與次級(jí)代謝有關(guān)的酶或其酶被解除了控制等原因，導(dǎo)致菌體的生理狀態(tài)發(fā)生改變， 發(fā)酵就從菌體生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)入產(chǎn)物合成階段 。 這個(gè)階段一般又稱為菌體生長(zhǎng)期或發(fā)酵前期，也有人稱為平衡期。 2022/5/30 17 產(chǎn)物合成階段 這個(gè)階段主要是合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，在此