【正文】 第三章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)技術(shù) 第一節(jié) 概述 一、動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的基本概念 二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的特點(diǎn) 三、發(fā)展歷史 四、動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件 (掌握） 五、體外培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性 (掌握） 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的基本方法 (掌握） 第三節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)和特性鑒定 (掌握） 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 第五節(jié) 細(xì)胞同步化（了解） 第六節(jié) 組織工程、器官培養(yǎng)（定義、培養(yǎng)方法及應(yīng)用（了解） 第一節(jié) 概述 一、基本概念 1．動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Cell and Tissue Culture) ：指從用無菌方法將動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞或組織取出，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使離體細(xì)胞或組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。 ? 是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。 ?分類： 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng) 原代培養(yǎng) (Primary Culture)： 亦稱初代培養(yǎng)，指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行培養(yǎng)的過程。 3． 繼代培養(yǎng)（ Secondary Culture ） ：亦稱傳代培養(yǎng)，從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱繼代培養(yǎng) . 細(xì)胞系 (cell line)： 由原代細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)初步純化，獲得的以一種細(xì)胞為主、能在體外長(zhǎng)期生存的不均一的細(xì)胞群體，一般為有限細(xì)胞系。 細(xì)胞株 (cell strain)：細(xì)胞系經(jīng)過克隆或其他方法而得的單一類型的細(xì)胞群體。 有限細(xì)胞系 (infinited cell line)： 不能連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株。 無限細(xì)胞系 (finited cell line)： 能夠連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞株，也稱無限系。 無限系細(xì)胞大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞。 細(xì)胞株、細(xì)胞系的命名： ??? 以組織來源定名，如 BHK(幼地鼠腎細(xì)胞 ) ??? 以人名定名，如 HeLa細(xì)胞 ??? 以時(shí)間地點(diǎn)來定名，如 S7811細(xì)胞系 ??? 以臨床疾病類型定名，如 BALL1細(xì)胞系 (來自 B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞 )) 用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞株 原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞 融合細(xì)胞 基因工程細(xì)胞 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 常用細(xì)胞株： CHO細(xì)胞、 Vero細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、 WI38細(xì)胞 二、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn) ? 動(dòng)物細(xì)胞 生長(zhǎng)緩慢 ，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)。 ? 更易受微生物污染 （包括細(xì)菌、真菌、病毒、支原體）， 需要 防治污染問題 。 ? 對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)性差，對(duì)環(huán)境極其敏感。包括 PH值、溫度、剪切力 ? 對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，除了氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，一般還需要血清。 ? 原代細(xì)胞一般繁殖 50代左右退化死亡。 總之，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)各方面的要求更高，培養(yǎng)難度更大。 平滑肌細(xì)胞 神經(jīng)元細(xì)胞 血紅細(xì)胞 形態(tài)上表現(xiàn)為多種多樣，如圓形、橢圓形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多邊形等． 三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷史 ? 1885年， Wilhelm Roux （勞斯，德國(guó)）最先嘗試離體培養(yǎng)雞胚神經(jīng)存活了一段時(shí)間。并且，他首次采用了“組織培養(yǎng)”一詞。 ? 1907年，美國(guó)胚胎學(xué)家 Ross Harrison （哈里森）培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出了軸突 （ 蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法） 。他被公認(rèn)為動(dòng)物組織培養(yǎng)的開山鼻祖。 ? 1912年 ,法國(guó)學(xué)者 Alexis Carrel（卡雷爾）采用雞胚勻漿組織液與血漿混合使用，培養(yǎng)了各種動(dòng)物組織的組織塊。在技術(shù)方面，卡雷爾把無菌操作技術(shù)引入組織培養(yǎng)中。1923年，他設(shè)計(jì)了卡氏培養(yǎng)瓶。 ? 1913年， Steinhardt建立了單蓋片懸滴培養(yǎng)法。 ? 1925年， Maximow采用雙蓋片法。 ? 1934年， Gey和 Lewis 用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)了許多細(xì)胞系。相繼，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種類型的培養(yǎng)瓶。 ? 1948年， Sanford創(chuàng)立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，建立了各種細(xì)胞系。他還創(chuàng)建了單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)方法。 ? 1951年， Pomerat設(shè)計(jì)了細(xì)胞培養(yǎng)灌流小室技術(shù)，使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液環(huán)境中，便于做細(xì)胞顯微攝影和代謝等研究 ? 1951年， 厄爾 （ Earle） 發(fā)明了體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基。 ?1952年． Gey建立了第一個(gè)人體細(xì)胞系，人體宮頸癌 Hela細(xì)胞系。 ?1960年， Barski等人在兩種不同類型的細(xì)胞混合培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)有自發(fā)的融合細(xì)胞。 ?1962年，岡田善雄又發(fā)現(xiàn)了已滅活的仙臺(tái)病毒可以誘發(fā)體內(nèi)艾氏腹水瘤細(xì)胞和非惡性細(xì)胞融合。且融合細(xì)胞染色體丟失，惡性特征受到抑制。 四、動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)一般條件 恒定的溫度 :37 ℃ ? 維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為 ℃ 177。 ℃ ，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。 培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過 39℃ 時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比； ? 人體細(xì)胞在 3940℃ 1小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)； ? 在 4041℃ 1小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)； ? 4142℃ 1小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能； ? 當(dāng)溫度在 43℃ 以上 1小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。 低溫下會(huì)使細(xì)胞代謝速率降低 pH：最適為 ～ ? 大多數(shù)細(xì)胞的適宜 pH為 ,偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響 .但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些 ,在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng) .但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長(zhǎng) ,如成纖維細(xì)胞最適合 pH是 ，每種細(xì)胞都有其最適 pH值 . ? 當(dāng) PH低于 6或高于 ，甚至死亡。 氣體 ? 氣體：需要 O CO2 （ 95%空氣、 5% CO2） ? 氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一 ,所需氣體主要有氧氣和二氧化碳 .氧氣參與三羧酸循環(huán) ,產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分 .開放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于 95%空氣加 5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中 . ? 二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物 ,也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分 ,它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的 pH值 . 營(yíng)養(yǎng)：要求高，需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、激素、生長(zhǎng)因子等。 無菌 ?培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。 （一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型 （二） 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn) （三） 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程 五、 動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生物學(xué)特性 貼壁依賴型細(xì)胞 非貼壁依賴型 成纖維細(xì)胞 上皮型細(xì)胞 游走型細(xì)胞 多形型細(xì)胞 （一）培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及類型 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng) 貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞 貼壁依賴型細(xì)胞 ? 含義：一是細(xì)胞之間相互接觸，二是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。 ? 單層附壁培養(yǎng)：指動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多細(xì)胞必須附著在固體表面生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞布滿表面后即停止生長(zhǎng)。 ? 在體外按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)不同，主要可分為以下幾類： 成纖維細(xì)胞型、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞 （ 1）成纖維細(xì)胞型： 本型細(xì)胞的形態(tài)似在體內(nèi)生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞； 長(zhǎng)梭形，細(xì)胞在支持物表面呈梭形或不規(guī)則三角形生長(zhǎng)，細(xì)胞核位于中央，胞質(zhì)向外伸出 23個(gè)長(zhǎng)短不同的突起， 生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀、漩渦狀走向 ，細(xì)胞間間隙較大。 其生長(zhǎng)特點(diǎn)為細(xì)胞一般并不緊靠相連； 中胚層細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為這一形式。如人胚肺細(xì)胞。 人的成纖維細(xì)胞 小鼠的成纖維細(xì)胞 人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（ MSC） 大鼠血管平滑肌細(xì)胞 成纖維細(xì)胞型 ?成纖維型細(xì)胞 在培養(yǎng)中的細(xì)胞凡形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似時(shí)，皆可稱之為成纖維細(xì)胞。本型細(xì)胞由形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)相似而得名 . 除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間質(zhì)起源的組織細(xì)胞常呈本類形態(tài)生長(zhǎng)。 ? 人胚肺細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為典型的成纖維細(xì)胞型。 （ 2） 上皮型細(xì)胞 ? 此類型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿支持物上生長(zhǎng)具有扁平狀，不規(guī)則。 ? 細(xì)胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，中央有 扁 圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層 細(xì)胞，呈現(xiàn) “ 鋪路石狀 ” 。 ? 生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。 ? 內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)都可能呈現(xiàn)上皮型。如皮膚、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等。 ? Hela細(xì)胞呈現(xiàn)為典型的上皮細(xì)胞型 。 單層扁平上皮細(xì)胞 人口腔皮樣癌細(xì)胞 人宮頸癌上皮細(xì)胞（ Hela） 成骨肉瘤細(xì)胞 (多角形 ) 上皮細(xì)胞型 奶牛腎臟上皮細(xì)胞 (上皮細(xì)胞型 ) ? 體外培養(yǎng)時(shí)所謂的上皮細(xì)胞型細(xì)胞或成纖維細(xì)胞型細(xì)胞，僅是因?yàn)槠湫螒B(tài)與體內(nèi)的上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞類似， 并不能將體外培養(yǎng)的這些細(xì)胞與體內(nèi)同名的細(xì)胞完全等同； 而且，這種名詞系使 用于描述細(xì)胞的外形而并非說明細(xì)胞的起源 。與這兩種形態(tài)類似的細(xì)胞，可能來自不同性質(zhì)的細(xì)胞亞類。取自不同組織的上皮細(xì)胞，其生化特征及其原來的形態(tài)要有差異，而來自不同組織的形態(tài)相似的成纖維細(xì)胞，其發(fā)展的方向可能并不相同 。 （ 3）游走型細(xì)胞： ? 不常見，具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。 ? 本型細(xì)胞在支持物上散在生長(zhǎng)，一般不連成片。細(xì)胞質(zhì)經(jīng)常伸出 偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng)，速度快且不規(guī)則。 ? 此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時(shí)亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。 ? 如單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞中的顆粒型白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。 ? 體外培養(yǎng)的游走型細(xì)胞具有類似巨噬細(xì)胞樣的特征。主要是：?jiǎn)魏司奘杉?xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞。 單 核 巨 噬 細(xì) 胞 游走型細(xì)胞在支持物上分散生長(zhǎng)，一般不連接成片、形成群落； 細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。 生長(zhǎng)位置不固定，呈游走和變形運(yùn)動(dòng)，速度快、方向不規(guī)則。 細(xì)胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。 單核巨噬細(xì)胞（未刺激狀態(tài)） 游走細(xì)胞型 單核巨噬細(xì)胞（活化劑刺激 6h后）：向四周伸展偽足 需要注意的是：在實(shí)際細(xì)胞培養(yǎng)中，可能同時(shí)存在 2種及其以上細(xì)胞形態(tài)；其影響因素包括（ 1）不同來源細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)不同；（ 2）不同培養(yǎng)條件下同一細(xì)胞表現(xiàn)不同形態(tài)；如血清成分，培養(yǎng)基，溫氣環(huán)境等 （ 4）多形型細(xì)胞： 形態(tài)上不規(guī)則的細(xì)胞， 不常見， 一般分胞體和胞突兩部分 ，胞突細(xì)長(zhǎng)形類似絲狀偽足；胞體略呈多角形，但較規(guī)則。如神經(jīng)組織細(xì)胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。 神經(jīng)細(xì)胞（ DAB顯色） 多形型細(xì)