【正文】 大規(guī)模基因組測序的 原理與方法 胡松年 元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ) 元素周期表 ―基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！ ―基因組” 生命科學(xué)的“元素周期表” 人體解剖圖奠定了現(xiàn) 代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ) 生命的奧秘蘊(yùn)藏于 “ 四字天書 ” 之中 … GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT… 基因組學(xué)的基礎(chǔ)理論研究 基因組學(xué)是要揭示下述四種整合體系的相互關(guān)系 : ? 基因組作為信息載體 （堿基對、重復(fù)序列的整體守恒與局部不平衡的關(guān)系） ? 基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體 (基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學(xué)機(jī)制的關(guān)系 ) ? 基因組作為生物化學(xué)分子的整合體 (基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系） ? 物種進(jìn)化的整合體 (物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇） 基因組學(xué)是一個 大學(xué)科 ? “界門綱目科屬種 ” ，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個基因組。 ? 基因組作為信息載體，它所儲存的信息是最基本的生物學(xué)信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點(diǎn)之一，又是生物信息的歸宿。 ? 基因組學(xué)研究包括對基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學(xué)研究。 ? 基因多態(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究。 ? 基因組學(xué)的研究必然要上升到細(xì)胞機(jī)制、分子機(jī)制和系統(tǒng)生物學(xué)的水平。 ? 基因組的起源與進(jìn)化和物種的起源與進(jìn)化一樣是一個新的科學(xué)領(lǐng)域。 ? 基因組信息正在以天文數(shù)字計算，規(guī)模化地積累，它的深入研究必將形成一個嶄新的學(xué)科。 基因組學(xué)是一門 大科學(xué) ? 基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律、和相互關(guān)系。 ? 基因組的信息含量高?；蚪M學(xué)的研究又在于基因組間的比較。 ? 基因組學(xué)的復(fù)雜性必然導(dǎo)致多學(xué)科的引進(jìn)和介入（各生物學(xué)科、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、計算機(jī)科學(xué)、化學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、電子工程學(xué)、考古學(xué)等）。 ? 基因組學(xué)研究的手段和技術(shù)已經(jīng)走在生命科學(xué)研究的最前沿。 ? 基因組信息來自于高效率和規(guī)模化所產(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)。 ? 人類基因組計劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。 基因組與生命之謎 ? 基因組的產(chǎn)生與進(jìn)化。 ? 基因組 DNA組分的變化、 GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。 ? 遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)化。 ? 內(nèi)含子（尤其是大于 100， 000 核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運(yùn)輸和降解。 ? 最小內(nèi)含子的生物學(xué)意義。 ? 動物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個性。 ? 物種衍變過程中基因組水平的變化。 ? 基因組大小變化與遺傳、分子、細(xì)胞機(jī)制的關(guān)系。 ? “ JUNK DNA”的發(fā)生、分類、進(jìn)化與功能。 測序設(shè)備的 壟斷和高速度換代 8 1990 2022 2020 Year 2022 2022 2022 1995 Mb1000 Mb4000 ABI373 ABI377 ABI3130 ABI3730 ABI3730xl GAI GAII Less Than 5 yrs HiSeq1000/2022 Mb4500 ABI3700 ABI3700xl SOLiD SOLiD2 SOLiD3 5500xl SOLiD ABI3130xl GAIIx 5500 SOLiD 測序設(shè)備發(fā)展現(xiàn)狀 9 ?第一代（穩(wěn)定需求） ?ABi ?3130xL ?3730xL ?3500xL ?第三代（即將面市） ?Helicos Biosciences ?Helicos Geic Analysis System ?Pacific Biosciences ?RSSystem ?第二代（高速發(fā)展） ?Roche ?Genome Sequencer FLX System ?GS Junior System ?Illumina ?Genome Analyzer IIx ?MiSeq ?HiSeq 1000 ?HiSeq 2022 ?Life Technologies (ABi) ?5500 SOLiD? System ?5500xL SOLiD? System ?Ion Torrent PGM? ?DanaherMotion ?Polonator ?Complete Genomics ?無錫艾吉因生物信息技術(shù)有限公司 ?AG100 ?深圳華因康基因科技有限公司 ?Pstar1 ?中科院北京基因組所 /半導(dǎo)體所 ?BIGIS1 ?BIGIS4 大規(guī)?；蚪M測序的幾個支撐技術(shù) ? Sanger雙脫氧末端終止 法 ? PCR 技術(shù) ? DNA 自動測序儀的發(fā)展 ? 生物信息學(xué)分析軟硬件設(shè)施 “雙脫氧末端終止 ” 的含義 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）原理 反應(yīng)所需物質(zhì)： DNA模板、引物、 DNA聚合 酶、 dNTP、緩沖液 每個循環(huán)包括： 變性（ 90℃ ）、退火（ 54 ℃ ）、延伸（ 72 ℃ ） Sanger 雙脫氧末端終止法測序原理 大 規(guī) ?；蚪M 測 序 的 兩 種 策 略 ?逐步克隆法 （ Clone by Clone） ?全基因組霰彈法 （ Whole Genome Shotgun) ………ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA…… ………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA…… 基因組 DNA BAC文庫 根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC 或 contig 用于霰彈法測序的候選克隆 用于霰彈法測序的亞克隆 測序并組裝 完整的基因組序列 逐步克隆法（ Clone by Clone） 全基因組霰彈法 （ Whole Genome Shotgun) 基因組 DNA 霰彈法克隆 測序并進(jìn)行全基因組序列組裝 完整的基因組序列 兩種大規(guī)模基因組測序策略的比較 項 目 策 略 全基因組霰彈法 逐步克隆法 遺傳背景 不需要 需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜） 速度 快 慢 費(fèi)用 低 高 計算機(jī)性能 高（以全基因組為單位進(jìn)行拼接） 低（以 BAC為單位進(jìn)行拼接） 適用范圍 工作框架圖 精細(xì)圖 代表測序物種 果蠅、水稻 人、線蟲 BAC by BAC Whole Genome Shotgun … the sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project carried to pletion by the methods described in this issue. Maynard V. Olson , The maps: Clone by clone by clone , Nature 409, 816 818 (2022) “Working Draft” (90%。 4X) Finished Genome (%。 8X) Gap1 Gap2 Chromosome 工作草稿（框架圖）與完成圖 BAC by BAC The sequence of the human genome C. Venter et al. Science 16 Feb. 291: 1304 – 1351, 2022 人類基因組計劃研究的主要成果和進(jìn)展表現(xiàn)在這 “ 四張圖 ” 上 ? 遺傳圖譜 又稱為連鎖圖譜（ linkage map），指基因或 DNA標(biāo)志在染色體上的相對位置與遺傳距離 ? 物理圖譜 以定位的 DNA標(biāo)記序列如 STS作為路標(biāo)，以 DNA實際長度即 bp、 kb、 Mb為圖距的基因組圖譜。 ? 轉(zhuǎn)錄圖譜 利用 EST（ expressed sequence tags 表達(dá)序列標(biāo)簽）作為標(biāo)記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜 ? 序列圖譜 通過基因組測序得到的，以 A、 T、 G、 C為標(biāo)記單位的基因組 DNA序列 逐步克隆法 （ Clone by Clone) 物理圖譜的構(gòu)建 大片段克隆的篩選 霰彈法測序與“工作框架圖”的構(gòu)建 序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建 物理圖譜的制作 物理圖譜的制作 ——序列標(biāo)簽位點(diǎn)（ STS）作圖 物理圖譜 是以特異的 DNA序列為標(biāo)志所展示的染色體圖。標(biāo)志之間的距離或圖距以物理距離如堿基對（ base pair； bp，Kb , Mb)表示。最精細(xì)的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。 STS圖譜 是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一， STS（ Sequence Tagged Site)本身是隨機(jī)地從人類基因組上選擇出來的長度在 200～ 300bp左右的特異性短序列（每個 STS在基因組中是唯一的， STS圖譜就是以 STS為路標(biāo)（平均每 100Kb一個），將 DNA克隆片段有序地定位到基因組上。 STS的來源 隨機(jī)基因組序列 表達(dá)基因序列，如 EST 遺傳標(biāo)記序列，如微衛(wèi)星標(biāo)記 有關(guān) STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫 GDB中找到 gdb. 物 理 圖 譜 構(gòu) 建