【正文】 大規(guī)?；蚪M測序的 原理與方法 胡松年 元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀物理、化學研究和發(fā)展的基礎 元素周期表 ―基因組序列圖”將奠定二十一世紀生命科學研究和生物產業(yè)發(fā)展的基礎！ ―基因組” 生命科學的“元素周期表” 人體解剖圖奠定了現(xiàn) 代醫(yī)學發(fā)展的基礎 生命的奧秘蘊藏于 “ 四字天書 ” 之中 … GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCA TCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCT CCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTC GCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT… 基因組學的基礎理論研究 基因組學是要揭示下述四種整合體系的相互關系 : ? 基因組作為信息載體 （堿基對、重復序列的整體守恒與局部不平衡的關系） ? 基因組作為遺傳物質的整合體 (基因作為功能和結構單位與遺傳學機制的關系 ) ? 基因組作為生物化學分子的整合體 (基因產物作為功能分子與分子、細胞機制的關系） ? 物種進化的整合體 (物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇） 基因組學是一個 大學科 ? “界門綱目科屬種 ” ，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個基因組。 ? 基因組作為信息載體，它所儲存的信息是最基本的生物學信息之一；既是生命本質研究的出發(fā)點之一，又是生物信息的歸宿。 ? 基因組學研究包括對基因產物（轉錄子組和蛋白質組）的系統(tǒng)生物學研究。 ? 基因多態(tài)性的規(guī)模化研究就是基因組多態(tài)性的研究。 ? 基因組學的研究必然要上升到細胞機制、分子機制和系統(tǒng)生物學的水平。 ? 基因組的起源與進化和物種的起源與進化一樣是一個新的科學領域。 ? 基因組信息正在以天文數(shù)字計算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個嶄新的學科。 基因組學是一門 大科學 ? 基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內在規(guī)律、和相互關系。 ? 基因組的信息含量高。基因組學的研究又在于基因組間的比較。 ? 基因組學的復雜性必然導致多學科的引進和介入（各生物學科、醫(yī)學、藥學、計算機科學、化學、數(shù)學、物理學、電子工程學、考古學等）。 ? 基因組學研究的手段和技術已經走在生命科學研究的最前沿。 ? 基因組信息來自于高效率和規(guī)?；a生的實驗數(shù)據(jù)。 ? 人類基因組計劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。 基因組與生命之謎 ? 基因組的產生與進化。 ? 基因組 DNA組分的變化、 GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。 ? 遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進化。 ? 內含子（尤其是大于 100， 000 核苷酸的大內含子）剪出后的運輸和降解。 ? 最小內含子的生物學意義。 ? 動物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個性。 ? 物種衍變過程中基因組水平的變化。 ? 基因組大小變化與遺傳、分子、細胞機制的關系。 ? “ JUNK DNA”的發(fā)生、分類、進化與功能。 測序設備的 壟斷和高速度換代 8 1990 2022 2020 Year 2022 2022 2022 1995 Mb1000 Mb4000 ABI373 ABI377 ABI3130 ABI3730 ABI3730xl GAI GAII Less Than 5 yrs HiSeq1000/2022 Mb4500 ABI3700 ABI3700xl SOLiD SOLiD2 SOLiD3 5500xl SOLiD ABI3130xl GAIIx 5500 SOLiD 測序設備發(fā)展現(xiàn)狀 9 ?第一代（穩(wěn)定需求） ?ABi ?3130xL ?3730xL ?3500xL ?第三代（即將面市） ?Helicos Biosciences ?Helicos Geic Analysis System ?Pacific Biosciences ?RSSystem ?第二代（高速發(fā)展） ?Roche ?Genome Sequencer FLX System ?GS Junior System ?Illumina ?Genome Analyzer IIx ?MiSeq ?HiSeq 1000 ?HiSeq 2022 ?Life Technologies (ABi) ?5500 SOLiD? System ?5500xL SOLiD? System ?Ion Torrent PGM? ?DanaherMotion ?Polonator ?Complete Genomics ?無錫艾吉因生物信息技術有限公司 ?AG100 ?深圳華因康基因科技有限公司 ?Pstar1 ?中科院北京基因組所 /半導體所 ?BIGIS1 ?BIGIS4 大規(guī)?；蚪M測序的幾個支撐技術 ? Sanger雙脫氧末端終止 法 ? PCR 技術 ? DNA 自動測序儀的發(fā)展 ? 生物信息學分析軟硬件設施 “雙脫氧末端終止 ” 的含義 PCR（聚合酶鏈式反應）原理 反應所需物質： DNA模板、引物、 DNA聚合 酶、 dNTP、緩沖液 每個循環(huán)包括： 變性（ 90℃ ）、退火（ 54 ℃ ）、延伸（ 72 ℃ ） Sanger 雙脫氧末端終止法測序原理 大 規(guī) 模基因組 測 序 的 兩 種 策 略 ?逐步克隆法 （ Clone by Clone） ?全基因組霰彈法 （ Whole Genome Shotgun) ………ATGCCGTAGGCCTAGC TAGGCCTAGCTCGGA…… ………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA…… 基因組 DNA BAC文庫 根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC 或 contig 用于霰彈法測序的候選克隆 用于霰彈法測序的亞克隆 測序并組裝 完整的基因組序列 逐步克隆法（ Clone by Clone） 全基因組霰彈法 （ Whole Genome Shotgun) 基因組 DNA 霰彈法克隆 測序并進行全基因組序列組裝 完整的基因組序列 兩種大規(guī)?；蚪M測序策略的比較 項 目 策 略 全基因組霰彈法 逐步克隆法 遺傳背景 不需要 需要（需構建精確的物理圖譜） 速度 快 慢 費用 低 高 計算機性能 高（以全基因組為單位進行拼接） 低（以 BAC為單位進行拼接） 適用范圍 工作框架圖 精細圖 代表測序物種 果蠅、水稻 人、線蟲 BAC by BAC Whole Genome Shotgun … the sequencing of the human genome is likely to be the only large sequencing project carried to pletion by the methods described in this issue. Maynard V. Olson , The maps: Clone by clone by clone , Nature 409, 816 818 (2022) “Working Draft” (90%。 4X) Finished Genome (%。 8X) Gap1 Gap2 Chromosome 工作草稿（框架圖）與完成圖 BAC by BAC The sequence of the human genome C. Venter et al. Science 16 Feb. 291: 1304 – 1351, 2022 人類基因組計劃研究的主要成果和進展表現(xiàn)在這 “ 四張圖 ” 上 ? 遺傳圖譜 又稱為連鎖圖譜（ linkage map），指基因或 DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離 ? 物理圖譜 以定位的 DNA標記序列如 STS作為路標，以 DNA實際長度即 bp、 kb、 Mb為圖距的基因組圖譜。 ? 轉錄圖譜 利用 EST（ expressed sequence tags 表達序列標簽）作為標記所構建的分子遺傳圖譜 ? 序列圖譜 通過基因組測序得到的，以 A、 T、 G、 C為標記單位的基因組 DNA序列 逐步克隆法 （ Clone by Clone) 物理圖譜的構建 大片段克隆的篩選 霰彈法測序與“工作框架圖”的構建 序列的全組裝與“完成圖”構建 物理圖譜的制作 物理圖譜的制作 ——序列標簽位點（ STS）作圖 物理圖譜 是以特異的 DNA序列為標志所展示的染色體圖。標志之間的距離或圖距以物理距離如堿基對（ base pair； bp，Kb , Mb)表示。最精細的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。 STS圖譜 是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一， STS（ Sequence Tagged Site)本身是隨機地從人類基因組上選擇出來的長度在 200～ 300bp左右的特異性短序列（每個 STS在基因組中是唯一的， STS圖譜就是以 STS為路標（平均每 100Kb一個），將 DNA克隆片段有序地定位到基因組上。 STS的來源 隨機基因組序列 表達基因序列，如 EST 遺傳標記序列，如微衛(wèi)星標記 有關 STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫 GDB中找到 gdb. 物 理 圖 譜 構 建