真核基因組dna提取(已修改)
2025-05-27 00:43 本頁面
【正文】 真核基因組 DNA提取 2021/6/17 教學(xué)內(nèi)容 ? 真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)、人類基因組計(jì)劃 ? 真核基因組提取的實(shí)驗(yàn)原理、操作說明、儀器使用及注意事項(xiàng) ? 基因組提取后的應(yīng)用：基因組文庫、 PCR及 southern blot ? RNA提取方法簡介 ? 核酸（ DNA和 RNA）定量及定性方法的介紹 2021/6/17 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 熟悉真核 DNA提取的方法和原理 ? 掌握真核生物基因組的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn) ? 分離純化核酸總的原則： ① 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； ② 排除其它分子的污染 （ 蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、外源 DNA、 RNA等） 。 ? 核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： ①核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； ②其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 核酸制備的一般原則 ① 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 ② 減少化學(xué)因素對核酸的降解（如過量酸堿） ③減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力（強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融）和高溫 ④防止核酸的生物降解（核酸酶的預(yù)防） 。 核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng) : ?核酸制備的步驟： 破碎細(xì)胞 提取 純化 －內(nèi)容物釋放 、純化 ，并去除雜質(zhì) ?核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變 pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。 對于 RNA，因分子較小，不易被機(jī)械剪切力拉斷，但抑制 RNase活力較難，故在 RNA提取中設(shè)法抑制 RNase更重要。 核酸制備的一般方法和原理 核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制 ① 加入少量 金屬離子螯合劑 ，如 mol/L EDTA或檸檬酸鈉， DNase基本可以全部失活。 ② 去垢劑、蛋白變性劑及 DNase抑制劑 也可使DNase失活。 核酸酶的抑制和抑制劑 RNase抑制 ①操作要帶手套。 ②所有器皿要嚴(yán)格消毒， ③試劑處理 ④低溫操作 ⑤在分離過程中要加入一定的 RNase抑制劑。 核酸制備中常用的去垢劑 用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3．對 RNase、 DNase有一定的抑制作用。 如： SDS、脫氧膽酸鈉、 4氨基水楊酸鈉、萘 、三異丙基萘磺酸鈉 核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用： 、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 ，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、 DEPC 1）破碎細(xì)胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、 SDS裂解。 高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。 細(xì)胞器 DNA：首先純化細(xì)胞器。 以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑 核酸提取的一般過程 2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì) 1．首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離 2．使核酸與蛋白質(zhì)分離 3．除去脂類 4．多糖的除去 核酸提取的一般過程 3）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染 ,并除去提取過程中的系列試劑 (鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 核酸提取的一般過程 4）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì) 溫
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